可视化鸡胚视顶盖发育过程中的切向细胞迁移

该方法有助于回答发育生物学领域的一些关键问题，例如神经元细胞迁移的机制。该技术的主要优势在于，能够长期检测单个细胞和集体细胞的迁移。采用碱裂解法分离200毫升细菌培养物后，将两种质粒混合，使每种质粒的终浓度为4 µg/µL。

将受精的鸡卵水平放置，在38摄氏度、70%相对湿度条件下孵育。孵育两天半后，使用20毫升注射器配18号针头，从鸡卵尖端一侧抽出5毫升蛋清。用胶带封住针孔。

接下来，使用弯头剪刀剪去蛋壳顶部，开一个直径为两厘米的孔。在体视显微镜下检查胚胎的发育阶段。用胶带将此较大的孔密封。

在38摄氏度、70%相对湿度条件下继续孵育至E5.5。电穿孔前，准备10微升含有0.5微升快绿染料的上述质粒DNA。同时，准备10毫升含100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的高压灭菌PBS溶液。

使用微量移液器拉制仪制备由玻璃毛细管制成的微量移液器。根据待注射DNA的量，将微量移液器远端尖部切割至适当的孔径大小。使用剪刀剪开已封口的顶部外壳，重新打开一个直径为2.5厘米的孔，并将卵稳定地置于体视显微镜下。

取少量制备好的 PBS 溶液滴加到卵内。用两把精细镊子小心剥离覆盖在胚胎上的尿囊膜，注意避免引起出血。然后从胚胎头部去除羊膜。

用显微解剖刀转动头部的同时，使用连接吸管的微量移液器将0.1至1微升的染色DNA注入左视顶盖的脑室腔内。将一对镊子型电极置于视顶盖的目标区域周围。使用脉冲发生器以30伏预脉冲充电1毫秒，间隔5毫秒，随后以6伏脉冲持续5毫秒，间隔10毫秒。

完成上述操作后，用胶带密封开孔处，并继续在38摄氏度和70%相对湿度条件下孵育。将电极浸泡在盛有PBS的塑料培养皿中，并使用牙间刷去除蛋白残留。对每个鸡蛋重复从初始蛋壳切割到电穿孔的整个过程。

在进行平铺培养前一天，开始准备编码的细胞培养插件：将蒸馏水加入10厘米细胞培养皿中，并进行高压灭菌。将若干细胞培养插件漂浮于水中。加入含有8微克/毫升层粘连蛋白和80微克/毫升聚-L-赖氨酸的溶液，确保完全覆盖插件。

在细胞培养用二氧化碳培养箱中，于37摄氏度下孵育过夜。在E7.0培养当天，从插入式培养小室中移除层粘连蛋白和聚-L-赖氨酸溶液，然后将插入式培养小室转移至含有1.1毫升培养基的玻璃底培养皿中。

将培养皿转移至37摄氏度的细胞培养二氧化碳培养箱中。在倒置共聚焦显微镜上设置加湿腔室，通入含40%氧气和5%二氧化碳的气体，温度设定为38摄氏度。开始在插入物上制备组织样本时，用镊子夹住胚胎头部，将其移至含有冰冻HBSS的6厘米细胞培养皿中。

使用两把精细镊子分离电穿孔的视顶盖，并用塑料滴管将其转移至底部铺有黑色硅胶并盛有冰冻HBSS的凹形玻璃培养皿中。在荧光体视显微镜下检查标记的位置。

使用显微外科刀切割标记周围中脑顶盖组织，同时注意记录组织在顶盖中的方向。随后，用塑料滴管将标记的组织转移至插入件中，使带针的一侧与插入件相连。将顶盖组织按所需方向放置，并去除多余的HBSS。

对拟用于同一插入件的其他组织样本重复上述组织制备过程。然后将培养皿放入倒置共聚焦显微镜的预制腔室中。使用倒置共聚焦显微镜检查荧光标记，并调节显微镜视野的焦距。

启动激光共聚焦单元。对共聚焦扫描进行采样，以调整组织在视野中沿x轴和y轴的方向和位置。接下来，选择扫描尺寸。

确定共聚焦扫描在 z 轴方向上的间隔和总范围。在 100 微米范围内，选择 5 或 10 微米的间隔。选择共聚焦成像的时间间隔以及总成像持续时间。

设置共聚焦成像程序参数后，开始采集图像。成像完成后，将不同C轴位置的共聚焦图像进行合并，以在每个时间点获得经过最终焦平面调整的Z轴层扫（z-stack）图像。随后将不同时间点的Z轴层扫图像依次连接，生成延时成像视频。

本研究通过卵内电穿孔、平铺细胞培养以及延时共聚焦成像技术，检测了浅层中的细胞迁移现象。图中显示了记录开始后0小时、9小时、18小时和27小时时视顶盖浅层中沿切向迁移的细胞及其细胞核。一段时长为28小时50分钟、每10分钟拍摄一次的延时录像，展示了迁移细胞及其细胞核的大规模运动过程。

融合后的视频清晰地展示了迁移细胞的大规模运动。通过关注从标记中心向各个方向扩散的细胞，可以分析细胞迁移的方向性。清晰的细胞核运动图像使得利用粒子追踪插件对细胞核迁移进行自动追踪成为可能。

可通过可视化切向迁移轨迹的时间变化，证明扩散性迁移具有全方位性。可每五分钟采集一次高倍放大图像，以研究单个细胞的行为及其前导突起、尾随突起和细胞核的连续形态变化。

完成此操作步骤后，可进行照明操作的标记。为回答有关阿克苏姆引导机制等其他问题。