通过荧光激活细胞分选（FACS）纯化特定细胞群体

您好，我是 Hope Campbell，来自威斯康星州血中心血液研究所的流式细胞术专家。您好，我是 STR Baso，Bonnie Dieter 博士实验室的研究生。我也在威斯康星州血中心血液研究所工作。

今天我们将进行使用荧光激活细胞分选技术来分离细胞的操作。我们在实验室中使用该技术来研究淋巴细胞和髓系细胞群体的功能。让我们开始吧。

在此实验中，将从小鼠脾细胞中纯化B细胞和CD4+ T细胞。起始靶细胞数量应根据所需细胞数量以及使用该方法时分选仪的回收率进行计算。B细胞和CD4+ T细胞的典型回收率为85%至90%。起始脾细胞群体中，B细胞约占60%至70%，T细胞约占20%至30%。

因此，如果起始细胞数为一亿个，则在开始分选前可获得5000万至6000万个B细胞以及2000万至3000万个T细胞。实验所需溶液与试剂应置于冰上。这些溶液包括含3%胎牛血清的磷酸盐缓冲液、以Hank's平衡盐溶液（HBSS）配制的含3%胎牛血清的25毫摩尔HEPES悬浮缓冲液、以胎牛血清配制的25毫摩尔HEPES-B溶液、染色抗体以及补偿微珠。

本方案还需要以下耗材和试剂：15 毫升锥形管、12 × 75 毫米聚苯乙烯或聚丙烯流式管。此外，还应提前准备好尼龙细胞滤网、台盼蓝和血细胞计数板以及分选收集管。

向流式管中加入300微升的he's FCS溶液，或向15毫升锥形管中加入1毫升的HEPs FFC S溶液。这些溶液应在收集过程开始前置于冰上。首先制备所需细胞群体的单细胞悬液。

若使用本实验步骤分离的细胞将进行培养，则整个细胞制备过程应在组织培养超净台中进行。采用无菌技术，加入预冷的染色缓冲液洗涤细胞一次，并通过反复倒置试管数次使细胞重悬。

然后在4°C条件下，以约250 × g离心细胞7至8分钟。洗涤条件可能因细胞类型和浓度而异。对于细胞，用10毫升染色缓冲液洗涤最多200 × 10⁶个细胞。

小心地吸去上清液，确保细胞沉淀保持完整。然后将细胞重悬于预冷的染色缓冲液中，浓度最高为每100微升含50 × 10⁶个细胞。通过轻弹管壁或轻轻涡旋振荡使细胞沉淀充分重悬。

然后将0.25至1×10⁶个细胞转移至一个新的12×75毫米的聚苯乙烯或聚丙烯流式管中，置于冰上。将此管留作后续使用的未染色对照样本。向第一管中加入一抗抗体，使细胞悬液达到所需的终浓度。此处使用PE-Texas Red标记的抗B220抗体对B细胞进行染色，同时使用ZI标记的抗TCRβ抗体和/或700标记的抗CD4抗体对T细胞进行染色，通过轻弹管底或轻微涡旋混匀。

涡旋后将细胞置于冰上，在避光条件下孵育20至30分钟。孵育结束后，通过重悬洗涤标记的细胞，将其悬浮于10 mL预冷的悬浮缓冲液中，并按前述方法离心。小心弃去上清液后，重复此步骤再次洗涤细胞一次。

最后，将细胞重悬于预冷的悬浮缓冲液中。如果一抗未直接偶联荧光染料，则向细胞悬液中加入标记的二抗或偶联染料的链霉亲和素（strep AVID），再次于冰上避光孵育20至30分钟。孵育结束后，用预冷的悬浮缓冲液洗涤细胞两次。

将细胞重悬于预冷的悬浮缓冲液后，使用台盼蓝等活体染料和血细胞计数板测定细胞浓度和活力。通过添加悬浮缓冲液将细胞浓度调整至每毫升10至20×10⁶个细胞，以避免因分离过程中死亡细胞形成的团块堵塞分选仪器。

实验步骤与染色。在开始分选方案之前，立即通过滴滤筛网过滤细胞。筛网的孔径应根据细胞类型选择，对于大多数细胞，使用孔径为 40 µm 的筛网。

根据体积，将过滤后的细胞收集到一个15升的锥形管或12 × 75毫米的流式管中。在设置细胞分选仪进行分选操作时，将细胞置于冰上。如果使用BD补偿微珠作为单色阳性对照，则需为实验中使用的每种荧光染料各准备一管对照样本，并额外准备一管未染色的阴性对照管。

充分涡旋振荡磁珠悬液后，将阴性与阳性磁珠悬液分别各取一滴，加入到每种颜色及阴性对照所用的100微升悬浮缓冲液中。接着，向每个阳性对照管中加入1微升标记抗体。本实验中，使用PE Texas'Red B二20抗体制备一个试管。

一份使用fit ETCR beta抗体，另一份使用lor 700 CD四抗体，通过轻轻弹击管底混匀，在室温避光条件下孵育15至30分钟。用两毫升染色缓冲液洗涤磁珠一次，以200 ×g离心10分钟。用抽吸法去除上清液，将磁珠沉淀重悬于200至500微升染色缓冲液中。

流式细胞仪的缓冲液设置因制造商而异，应仅由经过适当培训的人员操作。此处的细胞分选步骤将使用 BD defects aria 完成。分选前，应根据待分选的细胞类型选择合适的喷嘴。

可选的分选孔径尺寸为 70 微米、100 微米和 130 微米。喷嘴尺寸应至少为待分选细胞大小的三倍；对于淋巴细胞，选择 70 微米的喷嘴。可使用仪器的无菌分选选项进行无菌细胞分选。

使用此选项时，应根据制造商的说明，用70%乙醇对整个鞘液管路进行去污染处理。务必更换鞘液过滤器，并将PBS替换为无菌PBS。流式细胞仪准备就绪后，将预冷的收集管（内含大量FCS）放入相应的收集装置中。

现有的收集装置最多可容纳两个15毫升的锥形管、四个12毫米×75毫米的试管或四个微量离心管。收集少于1.5×10⁶个细胞时使用12毫米×75毫米试管，收集1.5×10⁶至4.5×10⁶个细胞时使用15毫升锥形管。

将合适的收集装置放入分选收集室中。对于多色分选，将侧流引导至已安装的收集装置。细胞仪需首先进行校准，以校正检测器之间的光谱重叠。

此处所示示例说明了 fit E 与 PE 发射光谱之间的重叠。深色阴影区域所示的这种重叠称为溢出（spillover）。在此情况下，PE 的溢出信号会被检测到 fit E 通道中，而 fit E 的溢出信号则会被检测到 PE 通道中。

必须校正这种溢出，以消除某一荧光通道在另一通道中的残余荧光信号。对溢出进行校正的过程称为补偿，可用来进行手动补偿。使用流式细胞术软件设置一个模板，该模板包含一个双变量图用于显示前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），以及为将要使用的每种荧光染料各设置一个直方图。

建立这些图谱的方法因软件而异。将阴性对照管放入流式细胞仪的上样口，并在样本运行时开始采集数据。调节FSC和SSC，使目标细胞群位于量程范围内。

然后调整荧光PMT设置，使阴性细胞群或自发荧光位于直方图最左侧区域。记录阴性对照管。将阴性对照管从流式细胞仪进样口取出，并替换为第一根阳性对照样品管。

现在开始采集。对每个阳性对照管重复此过程，并记录每个管的数据。针对每个阳性对照，在直方图上记录的事件周围绘制一个区间门控或方框。

然后在直方图的阴性区域绘制另一个区间门。进行手动补偿时，需考虑实验中使用的每种荧光素，通过调整阳性群体的中位值，使其与阴性群体的中位值相等。为调整中位值，应调节光谱重叠值，将其调高或调低，直至每种荧光参数的中位值尽可能接近匹配。

根据阳性对照和阴性对照样本确定的设置，通过确定实验样本的门控设置，准备分选程序。将待分选的细胞管放入流式细胞仪的上样口，以每秒9,000至10,000个事件的速度开始采集数据。选择点图以显示前向散射光与侧向散射光的关系。

前向散射是细胞大小的一般性指标，显示在x轴上，而侧向散射是细胞颗粒度的指标，显示在y轴上。现在圈选目标细胞群体。确定门控范围后，检查流式细胞仪上样口的温度是否已设置为4°C。

然后将实验样本管放入上样孔中。按下分选选项并开始采集，收集管应在装满后立即置于冰上。持续分选，直至收集到目标数量的细胞，或直至样本管排空为止。

然后再次选择分选按钮以停止分选，并从上样口取出样本。接着，将收集管直接放置在流式细胞仪的上样口，采集 500 至 1000 个事件。使用与 T 细胞分选相同的设置，分选后纯度从 21% 提高至 99%；对于 B 细胞，分选前起始 B 细胞群体为 5%，分选后提升至 98%。

我们刚刚向您展示了如何通过流式细胞术从单核细胞中纯化B细胞和T细胞群体。请记住，只要能够制备单细胞悬液并拥有合适的抗体，流式细胞术即可用于纯化任何细胞群体。此外，带有荧光标记的基因工程细胞无需使用抗体即可轻松实现纯化。

此外，请务必为实验设置适当的对照，始终检查流式细胞仪的激光配置，确保使用正确的荧光染料，并设置合适的圈门，使其准确围绕目标细胞群。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。