LED Thermo Flow —— 将光遗传学与流式细胞术相结合

本方法的总体目标是在流式细胞术测量过程中刺激光控物质。这种新型装置通过结合光控物质与流式细胞术的优势，有助于回答细胞信号传导领域中的关键科学问题。这是首次利用流式细胞术对光遗传学工具进行表征与分析。

直到今天，尚无任何可比的既定方法。首先，将转导的拉莫斯B淋巴细胞重悬于浓度为每毫升一百万个细胞的溶液中，并转移至玻璃FACS管。接着，将流式细胞仪的黑色O形圈更换为橡胶O形圈，并涂抹硅脂以形成更好的密封。

将玻璃管插入流式细胞仪中，并在关灯条件下将LED原型环绕放置于玻璃管周围。在GFP通道中测量Dronpa的荧光强度。该实验步骤中最关键的环节是玻璃管的处理。

玻璃FACS管非常易碎，因此建议在正式实验前先练习将玻璃管插入流式细胞仪。然后，打开位于管外的500纳米LED光源，继续测量Dronpa的荧光强度。逐渐增加LED光源的强度，直至Dronpa的荧光强度开始下降，以此估算测量Dronpa-Linker-Dronpa蛋白光转换所需的最低光照强度。

接下来，打开位于管外的原型400纳米LED光源，继续测量Dronpa的荧光强度。逐步增加400纳米LED光源的光强，直至Dronpa的荧光强度上升。首先，按照随附文本方案中的设计与制造说明，制备光控LED装置的内层和外层。

将波长为 400 和 500 纳米的 LED 插入设备的通道中。将其粘牢并按指示接线。这些特定波长将用于在 Dronpa-Linker-Dronpa 融合蛋白的暗态与亮态之间进行切换。

然后组装装置，并确保其密封不漏水，以防止在接通变压器电源前发生泄漏。装置组装完成后，收集Ramos B淋巴细胞，并将其悬浮于浓度为每毫升三百万至一千万个细胞的溶液中。将600微升细胞悬液转移至玻璃FACS管中。

将它们置于冰上，并在测量前避免光照。将组装好的装置连接至加热水泵，并将温度调节至37摄氏度。然后，小心地将玻璃FACS管插入装置，并将其连接至流式细胞仪。

在 GFP 通道中记录 Dronpa 荧光强度。该光遗传学装置的设计包含一个可连接循环水供应系统的腔室，以维持样品温度恒定。尽管该装置发射三种不同的波长，但在装置中流过 37 摄氏度的水时，FACS 样品中的温度仅出现轻微上升。

将Dronpa-连接子-Dronpa融合构建体克隆并转导至Ramos B细胞中。当使用500纳米光源将其诱导为单体状态时，其发射荧光强度降低；随后，当光源切换为400纳米时，Dronpa单体迅速转变为二聚体状态，荧光强度也随之迅速增强。

利用该装置，细胞质中的Dronpa-Linker-Dronpa融合蛋白能够被多次光转换。转换至暗态的过程较为缓慢，而转换至亮态则几乎瞬间完成。Dronpa在暗态下自发荧光恢复的现象表明，高效地光转换至亮态需要特定光照，且在无光照条件下仅能缓慢自发发生。

动力学分析表明，光控切换速度整体上具有很高的可重复性，即使在避光长时间孵育后，未经光控切换的荧光恢复也仅有约百分之十。按照此方法，可进行任何流式细胞术分析，包括钙流检测，以探究所选光遗传学工具的功能特性。该技术的建立将为光遗传学领域的研究人员探索细胞信号通路的连接机制提供重要途径。

观看本视频后，您应能充分了解如何为特定的光遗传学工具建立光控开关方案。请务必注意，紫外光可能具有极高危险性，在进行该操作时应始终采取预防措施，例如佩戴防护眼镜。