双分子荧光互补的流式细胞术分析：一种高通量定量研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法

本实验的总体目标是定位 ACAP LBC 与 PDE4D3 相互作用的位点。通过流式细胞术检测生物分子荧光互补（BC）的平均荧光强度来实现该目标。为此，将细胞转染表达 ACAP LBC 和 PDE4D3 片段的质粒，这些片段分别与荧光报告蛋白的 N 端或 C 端区域融合。

随后进行Venus流式细胞术检测，以评估蛋白片段相互作用后Venus是否完整并产生荧光。如果蛋白片段不发生相互作用，则无法检测到荧光。同时进行相应的西部印迹血液分析，以确定相对的蛋白表达水平。

通过将YFP的平均荧光强度与蛋白质表达水平进行归一化，计算蛋白质-蛋白质相互作用的强度。结果数据表明，PDE 43与ACAP LBC的结合由PDE 43内的多个区域介导，主要通过上游保守区1（UCR 1）。该技术相较于现有的方法（如免疫共沉淀和显微镜下的BP C）具有主要优势：操作相对简单、灵敏度高，并且能够实现对大量细胞的快速筛选。

尽管该方法可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用，也可用于筛选调节蛋白质-蛋白质相互作用的因子，从而服务于药物发现。通常，初学者会遇到困难，因为需要确定线性B响应。构建体的表达水平应相近，以便能够相互比较使用不同蛋白质片段所获得的结果。

在本实验中，细胞被共转染以下成分：YFP衍生物Venus的N端片段与全长ACAP LBC融合蛋白，以及Venus的C端片段分别与以下三种片段之一融合：全长PDE43、PDE43的上游保守区1（UCR1），或PDE43的上游保守区2加催化区（UCR2+CAT）。转染前一日，在6孔组织培养板中，每孔接种1.2×10⁵个HEK293T细胞，加入2 mL完全培养基。每组实验设置三个对照孔，以及每个检测组三个重复孔。

将Cotran在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。次日，准备转染BC血浆DNA构建体和CFP载体，后者与BS C构建体共转染作为标记。对于每种条件，将适量DNA加入250微升Optum M1无血清培养基中。

在无菌离心管中，一管足以转染三个孔。然后向稀释的 DNA 混合物中每微克加入三微升 Transit-LT1 试剂，用移液器轻轻吹打混匀，并在室温下孵育 30 分钟。孵育结束后，将 250 微升转染混合物逐滴加入细胞中，随后在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。

转染后，在落射荧光显微镜下观察荧光表达情况，细胞应呈现黄色荧光以指示BC信号，同时呈现CFP荧光以报告转染效率。为进行流式细胞术分析，首先用2毫升预冷的PBS洗涤细胞，然后加入250微升0.05%胰蛋白酶，于37摄氏度孵育2至5分钟以消化细胞。随后在显微镜下观察细胞脱落情况。

待细胞脱落后，加入一毫升 DMEM 中和胰蛋白酶。接着，将一毫升细胞悬液转移至一个微量离心管中，再将 0.25 毫升细胞悬液转移至第二个微量离心管中。以 500 ×g 离心五分钟。

250 微升样品将被进一步用于流式细胞术分析。将1毫升样品置于冰上，用于后续的全血分析，该分析应与离心重悬步骤平行进行。将细胞重悬于250微升FACS缓冲液中，并置于冰上。如果流式细胞术分析不会立即进行，细胞也可在含1%多聚甲醛的PBS中固定。流式细胞术使用配备488纳米、405纳米和642纳米固态激光器的Beckman Coulter Cyan ADP仪器进行。使用标准校准微球校准流式细胞仪后，采用Summit软件进行数据采集与分析，以线性刻度绘制前向散射光（FSC）对侧向散射光（SSC）的散点图，并圈选活细胞群体进行分析。

接下来，在非聚集的活细胞群体中，绘制SSC与电压脉冲宽度的关系图，并进行门控分析。然后，在该仪器上以线性刻度绘制FSC，以405 nm FL6通道的CFP荧光信号（对数刻度）为纵坐标，对非聚集的CFP阳性活细胞进行门控分析。最后，在该仪器上以线性刻度绘制FSC，以488 nm FL1通道的YFP荧光信号（对数刻度）为纵坐标，以观察BC的荧光强度。

接下来，运行Y-F-P-C-F-P双阴性样本，并调节F-S-C-S-S-C的FL1和FL6光电倍增管（PMT）电压，以设定每个信号的阈值。随后，运行YFP和CFP单阳性样本，用于后续离线补偿。确保获取至少10,000个门控事件。

最后，按照数据采集顺序收集实验样本的数据。根据采集设置分析方案，针对活细胞在FS与SSC散点图中划定门控一；在FSC脉冲与门控一的散点图中划定门控二，以筛选非聚集的活细胞；在ccfp与FSC散点图中基于门控二划定门控三，以筛选非聚集且ccfp阳性的活细胞。

使用YFP和CFP单阳性细胞对Yfp-CFP点图中的YFP和CCFP信号进行补偿后，确定CFP和YFP阳性细胞的分界线。将CFP阳性细胞的YFP平均荧光强度（MFI）导出至Excel用于数据作图，然后在Excel中将Y-F-P-M-F-I归一化至Western blotting测定的ACAP LBC PDE E 43及上样对照alpha tubulin的表达水平，以确定YFP平均荧光强度的线性范围。在HEK 293细胞中，将CFP与VN-ACAP LBC以及不同量的VC-PDE E 43共转染，并如本视频所述通过双分子荧光互补流式细胞术检测相互作用；该图显示VC-PDE E 43转染量变化时VC-PDE E 43表达的相对倍数变化。

由蓝色方块指示的CFP阳性细胞中Venus的平均荧光强度与VCDE 43的表达相关，并且与通过Western印迹图像分析确定的表达水平一致，后者由红色三角形表示。各样本间的CFP平均荧光强度相似，如绿色方块所示，该组作为阴性对照以限制细胞间的变异。这些结果验证了通过测量BS e的平均荧光强度，利用流式细胞术定量ACAB LB C PDE 43相互作用的可行性，同时可确定用于筛选的BIC构建体的合适用量，以绘制ACAP LBC在PDE E 43中的结合位点。该结论基于ACAP LBC与全长PDE E 43（fl）相互作用的BIC分析。

通过此方法评估了PDE 43的UCR一区以及PDE 43的UCR二区和CAT区，如图所示。vn ACAP LBC与VC PDE 43 UCR二区加CAT共表达时，BC信号较VC PDE 43全长（FL）和VC PDE 43 UCR一区更低。所有流式样本中蛋白表达水平相似，平均荧光强度经ACAP LBC PDE 43和α-tubulin的相对表达水平归一化处理。因此，归一化的B-C-M-F-I结果表明，ACAP LBC PDE 43全长（FL）与ACAP LBC PDE 43 UCR一区之间的荧光强度无差异，但ACAP LBC PDE 43 UCR二区加CAT相互作用的信号显著降低。

这些结果表明，PDE 43 中存在多个与 ACAP LBC 相互作用的区域，其中 PDE 43 UCR R 是与 ACAP LBC 相互作用的主要区域。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过 BP C 的流式细胞术分析来研究蛋白质-蛋白质相互作用。在进行该实验操作时，重要的是要记住确定使用适当量的 BP C 载体，以获得相似的蛋白表达水平和线性的 BP C 响应信号。在此步骤之后，可进一步采用其他方法（如肽段分析或风险分析）来确定 PDE 40 D 三中哪些氨基酸残基负责该相互作用。

其ACAP与红细胞的相互作用。