一种控制和分析细胞间相互作用中基因表达模式的光遗传学方法

本实验的总体目标是通过光遗传学控制和基因表达的实时监测，观察细胞间振荡信息的传递。该方法有助于解答关于细胞如何通过Notch信号通路相互交流的关键问题，特别是细胞如何将振荡信息传递给彼此。该技术的主要优势在于，我们能够以极高的精度控制并监测基因表达的动态过程。

演示该实验步骤的是来自我实验室的研究员Akihiro Isomura，他开发了这项新技术。为了将基于Tol2的光遗传学模块的质粒载体与转座酶表达载体共同转染到C2C12细胞中，首先使用细胞计数仪对胰蛋白酶消化后的细胞进行计数。在转染前一天，将50,000个C2C12细胞接种至12孔板的每个孔中。

随后，使用脂质体转染试剂共转染0.375微克基于Tol2的光遗传学载体、0.125微克药物筛选载体以及0.5微克转座酶表达载体。转染后一天，用胰蛋白酶消化转染的细胞，并将其接种至100毫米的培养皿中。将转染细胞的培养基更换为添加了100毫克/毫升潮霉素的培养基。

培养细胞三天，以清除未转染的细胞。注意，此过程中无需更换培养基。接下来，用胰蛋白酶消化转染后的细胞，并通过分选受体细胞和光敏细胞，富集表达荧光蛋白的细胞群体，具体操作详见文本方案。

设置两种类型的培养箱，一种带光源，一种不带光源，分别用于光照条件或黑暗条件。使用照度计设定蓝色LED透射光源的光照强度。关闭门后测量光照强度。

通过向单片机加载控制脚本，实现对光照程序的时间安排和持续时间的编程控制，从而设定可编程的光照时间表。使用细胞计数器对胰蛋白酶消化后的细胞进行计数，并将100,000个携带pAI218和pAI170的光敏感供体细胞接种至直径为35毫米的塑料培养皿中。将培养皿分别置于黑暗和光照条件的独立培养箱中。

接种细胞后，应保持培养箱门关闭，直至收集细胞裂解物。接种后一天半开始进行光照。避免细胞暴露于不受控的光照下，以防止产生不必要的光刺激。

因此，请在不打开门的情况下执行此步骤。注意，此处打开门仅用于演示。接种后约两天，以30分钟为间隔，将样本培养皿从培养箱转移至冰上，并开始制备细胞裂解液以进行后续分析。

为了实时监测PMT光刺激下细胞的响应，首先使用标准方法对发送细胞和接收细胞进行胰蛋白酶消化并计数。制备总体积为1毫升的细胞悬液，其中包含25,000个接收细胞和125,000个发送细胞。将混合后的细胞接种至24孔黑色培养板的每个孔中，培养基中需含有1毫摩尔的荧光素。

使用酶标仪对细胞进行荧光素酶检测分析，以确认输出信号不会超出记录系统的检测范围。接着，将培养板放置于记录系统中，并启动记录程序。例如，在设置记录后18小时开始光照。

为了在光遗传学扰动控制下对单细胞反应进行实时成像，首先将50,000个接收细胞和250,000个发送细胞接种到直径为27毫米的玻璃底、直径为35毫米的培养皿中。确保混合比例和总细胞数量已正确调整。接种后一天，用两毫升记录培养基更换原有培养基。

将玻璃底培养皿置于配备有环境控制舱的倒置显微镜上，环境控制舱设置为37摄氏度和5%二氧化碳。连接冷却式CCD相机，并确保CCD传感器的温度已降至设定值。

在自动采集软件中设置多维延时成像窗口的参数，以每5分钟一次的间隔采集图像，总采集次数超过288次。在多维延时成像窗口中选择一个发光通道。确保读出模式设置为慢速50千赫兹读出模式，这对于降低读出噪声以检测微弱的生物发光信号至关重要。

在多维延时成像窗口中，选择荧光通道。确保将读出模式设置为快速的1兆赫兹模式，以减少荧光成像所需时间。最后，设置2×2 binning，曝光时间为400毫秒。

接下来，选择一个日志选项卡，以设置周期性蓝光照射刺激细胞的时间表。点击加号按钮以添加新的日志设置。从日志框中选择一个日志文件，选择多个时间点，并在初始点和间隔框中设置数值，以安排刺激程序。

确保指定的期刊文件包含用于选择照明、打开快门、延迟、关闭快门和再次延迟的顺序化实验步骤。接下来，设置定时程序，以周期性的蓝光照射刺激细胞。最后，单击“采集”按钮开始延时记录。

最后，按照文本方案所述，从延时录像中提取发光信号通道的单细胞轨迹。此处展示了光遗传学发送-接收实验的代表性结果。在周期性蓝光照射下，光诱导型发送细胞产生了预期的Delta配体表达振荡模式。

当受体细胞与光敏的供体细胞共培养并暴露于重复的光照刺激时，实时生物发光记录系统可检测受体细胞在不同混合比例条件下的周期性响应。此外，结合重复光照的延时显微成像技术也揭示了受体细胞在单细胞水平上的同步响应。该技术建立后，为细胞生物学领域的研究人员探索基因表达的动态信息如何在细胞间相互作用中传递开辟了新途径。