用于实验性自身免疫性脑脊髓炎研究的小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的简单高效制备与纯化

本方案的总体目标是制备基于髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）胞外结构域的蛋白质，可用于诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）。该方案使任何实验室均可自行制备MOG蛋白，作为抗原用于诱导EAE。本方案的主要优势在于无需依赖专用的蛋白质处理设备，而是可以使用几乎所有免疫学实验室都具备的标准设备完成。

该实验方案是基于小鼠版本的MOG标签蛋白优化的，因此也适用于其他带有纯化用标签的MOG蛋白表达系统。取5毫升无菌培养基，接种BL21 MOG标签甘油菌，于37摄氏度、200转/分钟条件下过夜培养。向两个各装有500毫升无菌LB培养基的500毫升锥形瓶中，分别加入500微升浓度为100毫克/毫升的氨苄青霉素。将过夜培养物各取1毫升，分别接种至两瓶LB培养基中。

在37摄氏度、200 RPM条件下培养五小时，或培养至光密度达到0.6。当达到所需细胞密度后，向每个培养瓶中加入0.5毫升1摩尔的IPTG。将培养瓶置于37摄氏度、200 RPM条件下继续培养四小时，随后在室温、75 RPM条件下过夜培养。

将菌液均匀分配至适用于高速离心的250毫升离心瓶中，此后所有操作均需将离心瓶置于冰上。在4°C条件下，以22,000 × g离心15分钟，收集细菌细胞沉淀。将所有细菌沉淀重悬并合并于总共30毫升的裂解缓冲液中。

将此体积转移至约底部50毫升的离心管中，该离心管可耐受高速离心。将该离心管置于30°C水浴中孵育30分钟。在孵育期间，振荡离心管两次，以重新悬浮细胞。

孵育结束后，将离心管转移至冰上，于冰上以20千赫兹、70%振幅超声处理溶液，开启3秒，关闭3秒，共5个脉冲；重复此过程共六轮，每轮之间将溶液置于冰上冷却。随后，将溶液在4°C、24,000 ×g 条件下离心15分钟，弃上清，将沉淀重悬于30毫升缓冲液A中，并在4°C孵育3小时。孵育结束后，再次如前所述在冰上对溶液进行超声处理，然后向溶液中加入17.2克盐酸胍（guanidine HCl）。

将样品置于冰上孵育一小时，以溶解MOG标签蛋白。为使镍树脂结合并达到平衡，首先向每管含树脂的样品中加入40毫升水进行洗涤。将各管水平放置于摇床上，在4°C条件下振荡五分钟。

操作完成后，在 4 °C 条件下以 4500 × g 离心 8 分钟。用移液器小心吸弃上清液，避免扰动沉淀。然后向每个试管中加入 40 毫升平衡缓冲液。

将离心管置于摇床上，4摄氏度下振荡15分钟，然后按之前方法再次离心。弃去上清液，向各管中加入40毫升缓冲液B。将离心游戏副本置于摇床上，4摄氏度下振荡5分钟，然后再次对含有树脂的离心管进行离心。

为了纯化MOG标签蛋白，将溶解后的全部蛋白溶液转移至含有镍树脂的第一管中。混匀后，将该管水平放置于摇床上，在4°C条件下孵育1小时。在4°C条件下以4500 × g离心8分钟后，将上清液转移至第二管镍树脂中，并按前述条件进行孵育。

在此期间，将第一个管中的镍树脂重悬于40毫升洗脱缓冲液中，将试管水平置于摇床上，在4°C下孵育5分钟，然后按前述方法进行离心。将含有目标MOG标签蛋白的上清液转移至一个标记为“纯化的MOG标签蛋白”的250毫升瓶中。将此瓶保存在4°C环境中。

每完成一次洗脱步骤，将所得上清液收集至该瓶中。向第一根试管中的镍柱加入40毫升洗脱缓冲液，置于4摄氏度摇床中水平孵育5分钟。离心试管，弃去上清液，并如前所述重新活化镍柱。

完成后，对第二根管子重复与第一根管子相同的操作。经过四轮对可溶性蛋白在带电镍树脂上的吸附与洗脱，即可回收大部分蛋白。剪取约30厘米长的蛇皮透析管。

用止血钳夹紧一端，将蛇皮末端折叠三次，然后用止血钳夹住折叠端。用稀释的MOG标签蛋白填充蛇皮。然后通过挤压开口端，将蛇皮中的所有气泡排出。

最后，使用第二把锁紧止血钳封闭透析管的另一端。接着，将一升1×醋酸盐缓冲液与4摩尔胍基乙酸混合，倒入一个大桶中。将最多两段含有MOG标签蛋白的透析管放入桶中。

用胶带将止血钳固定在桶的侧面，以留出空间，使磁力搅拌子能在底部自由旋转。将桶置于4°C房间内的磁力搅拌板上，并开启至缓慢旋转速度。透析至少需要三天，以逐步降低缓冲液中胍的含量。

定期检查以确保透析管完整无损，且两端已牢固封闭。四至五小时后，向透析桶中加入1升1×醋酸盐缓冲液。此后每四至五小时重复此步骤，共重复三次，最终使桶中液体总体积达到4升。

弃去桶中一半的缓冲液后，补充一升一倍浓度的乙酸盐缓冲液，并连接好管路和搅拌子。最后，将桶中的四升缓冲液全部更换为四升新鲜的一倍浓度乙酸盐缓冲液，持续搅拌四到五小时。为获得最佳效果，建议在进行蛋白质浓缩当天执行此步骤。

为了浓缩MOG标签蛋白，用铝箔纸衬垫一支笔管，然后以1:1的比例在铝箔上覆盖PEG 3350和PEG 1000。PEG 3350有助于防止蛋白在浓缩过程中发生聚集，并具有良好的冷冻保护作用。将含有MOG标签蛋白的透析管置于铝箔上，再用PEG 8000覆盖。

将此溶液在室温下静置，并定期检查体积，直至体积等于或低于预估的最终体积。若在浓缩过程中透析袋因吸水过多而过饱和，则重新准备一个装有铝箔和 PEG 的容器。在纯化方案的各个阶段取蛋白样品，或通过 SDS-PAGE 凝胶电泳检测以确认其纯度。

图中显示了代表性凝胶结果，可见在 31.86 千道尔顿处高度纯化的 MOG 标签蛋白。为验证 MOG 标签蛋白是否正确折叠，采用流式细胞术检测了该蛋白与来自野生型 C57BL/6 小鼠或表达特异性识别 MOG 蛋白的免疫球蛋白重链的 IgH MOG 小鼠淋巴结中 CD19 阳性、CD4 阴性 B 细胞的结合能力。本方案从开始到结束至少需要 10 天。

在整个分离过程中，重要的是要追踪蛋白质的去向，并明确哪些组分需要保留，哪些需要弃去。使用六水合硫酸镍对镍树脂进行活化时，需格外注意，因为该物质具有极高危险性，应采取预防措施，避免吸入或接触皮肤及眼睛。观看本视频后，您应能够充分掌握如何自行表达并纯化MOG标签蛋白。

纯化后的MOG标签蛋白可在完全弗氏佐剂中乳化，并用作免疫剂以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。由MOG标签诱导的EAE可用于研究多种细胞类型（如CD4+或CD8+ T细胞或B细胞）在中枢神经系统自身免疫中的作用。与受MHC限制的短肽不同，蛋白抗原可在任何品系的小鼠中使用。