Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

该技术的总体目标是使用免疫磁性分离从新生小鼠幼崽中选择 O4 阳性少突胶质细胞，用于体外培养分析。这种方法可以帮助回答神经科学领域与研究影响髓鞘和髓鞘形成的疾病有关的关键问题。该技术的主要优点是，它有助于在大约小时内制备纯度大于 80% 的最终少突胶质细胞培养物。

首先使用小解剖剪刀沿着出生后第 5 至 7 天的小鼠头皮中线切割皮肤。缩回皮瓣露出头骨，然后沿着中线从背部开口到额部小心地切开头骨。从颅骨后部的开口开始，沿着骨头底部切向每个眼窝，然后用细镊子轻轻地将皮质从中脑中梳开。

然后，将皮质转移到含有 7 mL B-27 Neurobasal A 培养基的 60 mm 组织培养皿中。收集完所有大脑后，将皮质转移到一个新的 60 毫米组织培养皿中，该培养皿含有 5 毫升解离缓冲液，并使用 15 号手术刀刀片将皮质切成一立方毫米的块。将脑碎片在 37 摄氏度的 5%CO2 培养箱中孵育 20 分钟。

然后，加入 1 毫升牛生长血清以终止酶促反应。使用 10 毫升血清移液器，将组织浆液转移到 15 毫升锥形管中，然后用移液轻轻解离脑组织 6 到 8 次。让解离的组织块静置 2 到 3 分钟。

然后，将上清液转移到新管中。接下来，向组织中加入 3 mL Neurobasal A 培养基，补充有牛生长血清和 DNase I，并使用 5 mL 移液器通过更多移液轻轻分离组织。您会看到，适当的移液力对于确保活细胞的高产量至关重要。

如果移液太难，则活力可能较低。而如果移液太温和，细胞产量可能会很低。让组织块再静置 2 到 3 分钟。

然后，将上清液转移到新试管中，向组织中加入 3 mL 新鲜的 Neurobasal A 培养基，其中补充有牛生长血清和 DNase I。用 P-1000 移液器吸头轻轻解离脑组织，直到没有大块组织残留，注意避免气泡。使用 10 毫升移液器通过 70 微米细胞过滤器将细胞溶液过滤到 50 毫升锥形管中，并使用新鲜的 Neurobasal A 培养基将单细胞悬液的最终体积降至 30 毫升，补充有牛生长血清和 DNase I.将细胞悬液分成两个 15 毫升锥形管， 并通过离心沉淀神经细胞。

除最后 5 至 10 μL 混浊上清液外，去除所有上清液，并向细胞中加入 3 mL 补充有牛生长血清的 Neurobasal A 培养基。小心地重悬细胞沉淀，并使用含有 10% 牛生长血清的新鲜 Neurobasal A 培养基使最终体积达到 15 mL。通过 40 微米细胞过滤器将细胞溶液过滤到新的 50 mL 锥形管中，并使用含有 10% 牛生长血清的新鲜 Neurobasal A 培养基使最终体积达到 30 mL。

然后，将过滤后的细胞悬液分装在两个 15 mL 锥形管中进行离心。并在混合细胞之前将沉淀重新悬浮在 2.5 mL 冰冷的磁性细胞分选缓冲液中。计数后，再次离心细胞，并将沉淀重悬于 90 微升新鲜磁性细胞分选缓冲液中，每 1 乘 10 至 7 个细胞中。

接下来，向 7 个细胞中每 10 乘以 10 加入 10 微升抗 04 微升，轻轻轻弹混合细胞溶液。在 4 摄氏度下放置 15 分钟后，每 5 分钟轻轻轻弹一次，向 7 个细胞中轻轻加入 2 毫升磁性细胞分选缓冲液，每 1 乘 10 次，离心洗涤，然后小心真空抽吸弃去上清液。将沉淀重悬于 500 微升新鲜的磁性细胞分选缓冲液中，每 1 次 10 至 7 个细胞，并将适当大小的磁珠分选柱放入相应的磁性分离器中。

将 40 微米过滤器放在色谱柱上，并用 3 mL 磁性细胞分选缓冲液预冲洗过滤器，让缓冲液流过色谱柱，不要让色谱柱干燥。将细胞加入过滤器中，然后用 Magnetic Cell Sorting Buffer 洗涤 1 mL。每次洗涤用 3 mL 磁性细胞分选缓冲液洗涤柱 3 次，用少突胶质细胞增殖培养基洗涤 1 次。

然后，将色谱柱转移到 15 mL 试管中，并使用柱塞立即将 5 mL 新鲜的少突胶质细胞增殖培养基冲洗到色谱柱中。计数后，将细胞稀释至适当的铺板密度，并在 24 孔板中用 100 μL 少突胶质细胞增殖培养基替换预包被盖玻片上的层粘连蛋白。将少突胶质细胞在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育不超过 45 分钟，以促进少突胶质细胞粘附在盖玻片上。

然后，用 500 μL 少突胶质细胞增殖培养基淹没 24 孔板的每个孔，孵育 24 小时。第二天，用少突胶质细胞分化培养基替换上清液，并将细胞放回培养箱中，直到它们准备好固定。铺板后 24 小时，细胞在相差显微镜下呈双极或三极，这是早期增殖少突胶质细胞的特征。

免疫荧光染色显示，铺板后 24 小时，这些前少突胶质细胞中的大多数也表现出 NG2 和 O4 标记，而用 GFAP 和抗 01 抗体标记则少见得多，表明这个阶段的大多数细胞是前少突胶质细胞，很少有未成熟或成熟的少突胶质细胞。72 小时时，少突胶质细胞形态似乎比 24 小时时更复杂，并且早期少突胶质细胞标志物 NG2 阳性的细胞频率要低得多。此外，大多数细胞表现出 O4 标记，在这个阶段几乎有一半的细胞进行了 01 抗体染色，表明细胞正在分化为更成熟的表型。

值得注意的是，星形胶质细胞的存在仍然极低。这些结果表明，随着时间的推移，免疫磁分离的少突胶质细胞能够在体外分化到成熟的第三阶段，而其他细胞类型（如星形胶质细胞）的污染非常小。看完这个视频，你应该对如何使用免疫磁性分离从新生小鼠幼崽中分离原代少突胶质细胞有了很好的了解。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四个小时内完成。感谢观看。祝你的实验好运。