制备与 体外 用于磁共振成像的树状大分子对比剂的表征

本实验的总体目标是展示一种树枝状顺磁性螯合物的制备与表征方法，该螯合物可作为磁共振成像的对比剂，并通过成像实验验证其性能。该方法有助于回答磁共振成像对比剂领域中的关键问题，例如树枝状对比剂的性质及其成像效能。该技术的主要优势在于能够便捷地制备出高效且具有高蛋白含量的磁共振成像对比剂，从而确保其易于表征。

该方法可进一步拓展至树状结构 MRI 对比剂的结构修饰与功能优化，这对于其潜在的体内应用具有重要意义。该研究意义延伸至生物医学研究与诊断成像领域，因为树状对比剂较高的分子量可导致更长的组织滞留时间，并显著增强 MRI 信号。首先，将一克大环前体 DO3A 三丁酯溶解于五毫升 DMF 中。

加入0.67克碳酸钾，室温下搅拌45分钟。在一小时内分批加入0.87克叔丁基-2-溴-4,4-硝基苯基丁酸酯，继续搅拌反应混合物18小时。然后，在40至60摄氏度下通过球对球减压蒸馏除去DMF。

用硅胶柱层析纯化残留物，得到环状固体。将1克该固体溶解于10毫升乙醇和150微升甲醇中的7 N氨溶液的混合液中。加入150毫克负载在活性炭上的钯，并将反应瓶安装至氢化装置中。

在2.5 bar氢气氛围下振荡混合物16小时。将硅藻土的乙醇悬浮液倒入烧结玻璃漏斗中。将反应混合物通过硅藻土过滤，以除去钯碳催化剂。使用旋转蒸发仪除去滤液中的溶剂。

将所得固体溶于15毫升二氯甲烷和四当量三乙胺中。向其中加入1.3当量的硫光气，在室温下搅拌反应混合物16小时。使用旋转蒸发仪除去反应混合物中的溶剂，并通过硅胶柱色谱法纯化残余物，得到浅棕色固体状的DOTA型单体。

将10%的甲醇溶液中的G4 PAMAM树状大分子通过40摄氏度旋转蒸发除去溶剂，得到66.7毫克。将该树状大分子溶解于4毫升DMF中。向树状大分子溶液中加入0.105毫升三乙胺，在60摄氏度下搅拌45分钟。

然后在一小时内分批加入354毫克单体。在45°C下继续搅拌48小时。通过球对球真空蒸馏除去溶剂。

将疏水性凝胶过滤介质在室温下与甲醇混匀，涡旋震荡三小时，装填凝胶过滤色谱柱。以甲醇为洗脱液，收集每份1毫升的洗脱组分。采用薄层色谱法分析各组分。

在旋转蒸发仪上除去含有受保护树枝状螯合剂的组分中的溶剂。对该化合物进行核磁共振氢谱测定，并对芳香区和脂肪区信号进行积分。利用这些数值，确定偶联到G4 PAMAM树枝状聚合物上的受保护DOTA型大环配体的数量。

为了脱保护产物，将固体溶解于5毫升甲酸中，在60摄氏度下搅拌混合物36小时。使用旋转蒸发仪除去甲酸。将从旋转蒸发仪中得到的残余物冷冻干燥，以获得树状大分子螯合剂。

使用质子核磁共振（NMR）确定与树枝状聚合物偶联的大环单元数量。将冻干的螯合剂溶于水中，用0.1摩尔氢氧化钠调节溶液pH至7.0。

在四小时内，将113毫克三氯化钆溶于1毫升水的溶液逐滴加入螯合剂溶液中。 periodically 用0.05摩尔氢氧化钠调节pH至7.0。室温下搅拌混合物24小时。

然后，在四小时内分批加入 158 毫克 EDTA，并根据需要将 pH 值调回 7.0。在室温下继续搅拌 24 小时。使用在水中溶胀的亲水性凝胶过滤介质装填尺寸排阻色谱柱。

浓缩反应混合物，将混合物上样至层析柱，并用去离子水洗脱。将纯化后的样品在3 kDa离心过滤装置中，于1,800 ×g离心30分钟。重复过滤约五次，以去除过量的钆和EDTA。

使用二甲酚橙试验确认滤液中无游离钆离子。去除过滤后样品中的挥发性物质，并将残留物冷冻干燥，得到树状大分子对比剂。将DCA溶于水，配制浓度为5至10毫摩尔/升的储备液。

为确定精确的DCA浓度，首先将360微升的储备溶液与60微升的D2O及叔丁醇标准溶液混合。取400微升样品置于外层核磁共振管中。将含有叔丁醇和水参考溶液的同轴核磁共振插入管放入样品管内。

获取质子核磁共振谱，并测量参考溶液与样品溶液中叔丁醇信号之间的频率偏移。使用所示公式计算DCA浓度，校正样品中添加的叔丁醇。以相同方法测定市售GdDOTA溶液的浓度。

将DCA和GdDOTA溶液置于HEPES缓冲液中，水对照置于两组塑料小瓶中。盖上瓶盖并确保无气泡存在。用一支60毫升注射器，水平装入0.01和0.02毫摩尔的DCA样品、一份0.5和1.0毫摩尔的GdDOTA样品，以及两份水对照样品。

使用第二个60毫升注射器加载第二组样品，重复此操作。用1毫摩尔的GdDOTA溶液填充每个注射器，并盖紧注射器前端。将其中一个注射器水平放置于磁共振成像仪中，使样品相对于扫描仪呈垂直状态。

将注射器滑入扫描仪中心。选择解剖扫描以将注射器定位在磁体的等中心位置。然后按下交通灯按钮，以调整初始扫描参数并启动扫描。

选择快速/慢速角度激发成像方法进行T1加权成像，或选择弛豫增强快速采集方法进行T2加权成像。使用定位扫描选取冠状面切片以对垂直排列的样本进行成像。优化对比度与噪声的采集参数，并采集图像。

使用圆形 ROI 确定背景及每个样本的平均信号强度和标准偏差。计算信噪比。核磁共振（NMR）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和元素分析表明，平均有 49 个大环单元与 G4 PAMAM 树状大分子发生偶联。

还通过核磁共振（NMR）测定了DCA溶液的浓度及其纵向和横向弛豫时间。将所得的弛豫率值与一种 commercially available 且临床使用的 GdDOTA 单体进行了比较。同时，也将 DCA 的性能与 GdDOTA 单体进行了比较。

两组溶液的钆浓度相似，这是根据偶联的大环单元数量确定的；另外两组溶液的分子浓度相似。在钆浓度相似的T1加权成像实验中，DCA的信噪比略高于GdDOTA。当溶液的分子浓度相同时，DCA的信噪比约为GdDOTA的三倍。

在T2加权成像实验中，两种浓度条件下DCA的信噪比均显著低于GdDOTA，尤其在较高DCA浓度下更为明显。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备经过纯化和表征的树状大分子MRI对比剂。通过该方法，可通过修饰分子结构单元，便捷地制备和分析不同类型的树状大分子及纳米级MRI对比剂。

掌握该技术后，从事磁共振成像对比剂开发领域的研究人员应能够制备一系列特异性探针，以开展当代分子影像学中具有重要意义的多种功能研究。