人5-羟色胺转运蛋白与配体结合的热稳定化、表达、纯化及结晶 S西酞普兰

本实验的总体目标是获得一种具有足够稳定性的转运蛋白，以用于结构研究，并利用这种经过改造的转运蛋白生长出可用于高分辨率X射线晶体学分析的晶体。该方法可解答结构生物学领域中的关键问题，例如如何解析作为重要药物靶点的膜蛋白的结构。该技术的主要优势在于，可通过功能测定方法从药物结合构象中进行筛选。

尽管该方法可用于研究神经递质转运蛋白，但也适用于具有高亲和力结合小分子的受体、通道蛋白以及可溶性蛋白。将经胰蛋白酶处理的HEK293S GnTI缺陷细胞充分重悬于添加了10%胎牛血清的DMEM培养基中，调整细胞密度至每毫升50万个细胞，并置于一次性移液管储液槽中。使用多通道移液器，向每孔预先包被多聚-D-赖氨酸的培养板中加入100 µL细胞悬液。

每块板加样后，轻轻吹打移液槽中的细胞悬液，以确保细胞均匀分布。将细胞置于37摄氏度、含8%二氧化碳的培养箱中孵育。在转反式作用实验前一小时更换细胞培养基。

在待筛选的cert TC背景下，为每种构建体将450纳克DNA与45微升无血清DMEM混合，以制备DNA转激活试剂复合物。然后将1.6微升转激活试剂加入45微升无血清DMEM中并混匀。立即将稀释后的转激活试剂溶液加入DNA溶液中，并混匀。

切勿以相反顺序混合溶液。在向其中四个孔中加入20微升转染试剂DNA混合物之前，等待10至15分钟。在室温下，用200纳摩尔的西酞普兰和25微升TBS孵育细胞5分钟。

为了溶解细胞，向细胞中加入25微升含有8毫摩尔C12M、1毫摩尔CHS和蛋白酶抑制剂混合物的TBS溶液。在室温下孵育细胞1小时。然后向每种构建物的三个孔中各加入50微升TBS溶液，其中包含20纳摩尔氚标记的西酞普兰、0.1%牛血清白蛋白以及毫克/毫升的His标签亲和闪烁接近分析（SPA）珠。

对于最后一个孔，加入相同的 TBS 溶液，但需补充 100 微摩尔的舍曲林，以确定非特异性结合。在将 His 标签亲和 SPA 珠加入 96 孔板时，应确保充分混匀。使用 96 孔闪烁计数器在室温下测定氚标记西酞普兰的结合，每孔计数时间为一分钟。

继续计数平板，直至总菌落数在约36小时时达到平台期。测量后，将平板置于带有加热盖的加热块中，在33摄氏度下加热15分钟。加热后再一次测量氚标记的西酞普兰结合量。

修改加热步骤后重复上述操作。根据目标蛋白的表观熔解温度以及最稳定构建体的热稳定性调整加热温度。持续加热各孔板，直至所有构建体的特异性计数均降至较低水平。

在37摄氏度、8%二氧化碳和85%湿度条件下，于130转/分钟的摇床中悬浮培养HEK293S GnTI缺陷细胞，使用添加了2%胎牛血清的293表达培养基。以感染复数为2、细胞密度为每毫升300万个细胞的条件，用P2病毒感染10升上述细胞。感染后12至16小时，从1摩尔储备液中加入丁酸钠至终浓度为10毫摩尔。

感染后48至60小时，以4,000 × g离心15分钟收集细胞。弃去上清液。用含2 µM艾司西酞普兰或其他SERT抑制剂的150毫升TBS重悬细胞。

将10升培养物的细胞置于约30摄氏度的温水中，通过快速使用10毫升移液器反复吹打细胞直至均匀悬浮。将所有细胞转移至含有搅拌子的烧杯中，在搅拌条件下加入全部去污剂溶液。在4摄氏度下搅拌孵育一小时，使细胞充分溶解。

在4°C条件下，以8,000 × g离心裂解液15分钟。将上清液倾入干净的超速离心管中，弃去沉淀。随后，在超速离心机中以100,000 × g离心上清液1小时。

超速离心后，将上清液通过0.2微米滤膜过滤，并弃去沉淀。接下来，使用蠕动泵将裂解液以洗脱缓冲液平衡过的柱子加载到10毫升链霉亲和素亲和树脂上。然后将链霉亲和素亲和柱连接至快速蛋白液相色谱系统，并以每分钟2毫升流速用66毫升洗脱缓冲液洗涤柱子。

使用33毫升洗涤缓冲液，以每分钟0.5毫升的速度洗脱纯化的蛋白，缓冲液中添加5毫摩尔的脱硫生物素。收集每1毫升的组分。主峰组分体积约为10毫升。

为了形成转运蛋白-抗体复合物，首先在室温下用凝血酶消化纯化的蛋白过夜，以去除标签，并用内切糖苷酶H进行去糖基化。使用截留分子量为100千道尔顿的离心式蛋白浓缩器，将蛋白浓缩至浓度为10毫克/毫升，体积为250至300微升。在体积小于500微升的条件下，按1:1.2的摩尔比将浓缩后的SERT蛋白与8B6 Fab混合。

将混合物在 100,000 × g 和 4 °C 条件下离心 20 分钟。离心后，收集含有 SERT Fab 复合物的上清液，并弃去沉淀。使用尺寸排阻柱通过快速蛋白液相色谱分离该复合物。

用添加物TBS以每分钟0.5毫升的流速进行平衡。在结晶前，使用截留分子量为100千道尔顿的离心式蛋白浓缩器，将复合物分离所得的峰馏分浓缩至每毫升2毫克。在280纳米处吸光度为2 AU相当于每毫升1毫克。

以每0.05个复合物对应1个游离Fab的比例加入额外的Fab。同时加入10 µM游离的S-西酞普兰。离心样品后，收集含有SERT-Fab复合物的上清液，并弃去沉淀。

根据文本方案中的表一，在 4 摄氏度下设置一个悬滴 24 孔筛。将每种储液溶液各 500 微升移液至一个低剖面 24 孔板中，并在每个孔上加密封剂。将 1.5、1.75 和 2 微升的 SERT Fab 复合物移液至一张 18 毫米硅化玻璃盖玻片上。

然后将一微升储液加到蛋白质样品上方。单晶将在约三天内出现，并在14天后生长至100至175微米。此处展示的是在含氚西酞普兰存在下进行热稳定性筛选的代表性结果。

熔解温度值与最大结合量的对应关系显示了具有高热稳定性和表达水平的突变体。图中展示了野生型 SERT TC 以及三个最佳突变体 Y110A、I291A 和 T439S 的热稳定性曲线。此显微镜图像显示表达 SERT CC 的 HEK293S GnTI 缺陷细胞，细胞膜上可见绿色荧光。

SERT CC 的荧光检测尺寸排阻色谱显示在 15 毫升处有一个主峰。SDS-PAGE 分析显示为单一蛋白质条带，基本无污染物。图中展示了通过尺寸排阻色谱分离转运蛋白抗体复合物的代表性结果。

在11.5毫升处洗脱的主要峰包含SERT和Fab，这在SDS-PAGE凝胶上可见。生长两周后，SERT抗体复合物与S-西酞普兰结合的光学显微镜图像显示，存在约100至175微米的棱柱状晶体。观看本视频后，您应能充分理解如何鉴定可稳定配体结合构象下膜蛋白的突变，以及如何利用蛋白-抗体复合物进行结晶筛选。

在进行该实验操作时，必须注意配体对于 SERT TC 的稳定至关重要，并且是 SERT CC 结晶所必需的。该技术的应用意义在于精神类疾病的治疗，因为 SERT 是多种抗抑郁药物的分子靶点。完成该操作后，可利用生物化学与生物物理方法对纯化的 SERT 功能进行表征。