人源脂质敏感型阳离子通道TRPC3的表达与纯化及其通过单颗粒冷冻电镜进行结构解析

本方案使我们能够解析人源TRPC3的结构，TRPC3属于一类重要但研究尚不充分的离子通道家族。该技术的主要优势在于其高效性，可广泛应用于多种蛋白质的表达与纯化，适用于结构与功能研究。该方法可提供高效的蛋白质表达与纯化系统，用于蛋白质生物化学与生物物理学研究，并可推广至多种离子通道及其他膜蛋白的研究。

首先，通过观察病毒生产培养物样品中病毒的GFP荧光来检测相对病毒表达水平。在足够大小的带挡板底部的锥形培养瓶中，制备适量体积的HEK293哺乳动物细胞悬浮培养液，细胞浓度为每毫升350万至380万个细胞，培养基为添加了1%无菌FBS的表达培养基。加入体积比为8%的P2代病毒原液，并在37°C、135 RPM条件下于摇床中孵育。

感染后12至18小时，加入10毫摩尔的丁酸钠，于30摄氏度孵育至蛋白表达达到最佳所需时间。随后，在2,880 × g离心20分钟以收集细胞。每升收获的细胞用约100毫升TBS洗涤并重悬。

再次在2,880 × g下离心20分钟，并收集细胞沉淀。同时在不同时间点收集少量（1毫升）的细胞沉淀样品，在4°C条件下加入不同的去垢剂和/或添加剂，振荡溶解2小时。将这些少量全细胞溶解样品在4°C下以235,000 × g超速离心10分钟，以澄清溶液。

然后，将样品以30微升为一份在尺寸排阻色谱柱上进行分析，以确定最佳表达时间和最佳溶解条件。每升收获的细胞用100毫升缓冲液重悬沉淀并解冻。细胞解冻后，用移液器吹打或搅拌，以确保溶液均匀。

将细胞置于冰浴中的烧杯内，在4°C条件下搅拌溶解2小时。随后，在4°C下以235,000 ×g超速离心1小时，去除细胞碎片。取30 µL上清液样品，通过HPLC在SCC柱上进样，以测定蛋白含量，并通过GFB信号输出观察目标蛋白。

将含有可溶性蛋白的钴亲和树脂结合上清液上样至重力柱中，并收集穿流组分。取30微升穿流组分样品在SCC柱上进行检测，以确认蛋白是否结合到树脂上。随后，用10个柱体积的缓冲液洗涤树脂。

取30微升洗涤液样品在SCC柱上运行，以检测是否存在蛋白损失。用缓冲液洗脱树脂结合的人TRPC3蛋白。取90微升洗脱液样品，按1:100稀释后在SSC柱上运行，以确认蛋白已被洗脱，并验证在与目标蛋白大小相应的位置是否存在GFP信号。

按1:20的摩尔比加入凝血酶，并向洗脱样品中加入10毫摩尔的EDTA。在4摄氏度下孵育三小时。孵育结束后，将洗脱液转移至15毫升离心过滤管中。

在4°C条件下，以2,800 × g离心5分钟，逐步将洗脱液浓缩至500微升或更少。每次离心间用移液器轻轻吹打蛋白溶液，重新悬浮蛋白，防止过度浓缩。将浓缩后的样品加入SSC柱中，并用缓冲液洗脱。

进行快速蛋白质液相色谱，收集每份300微升的组分。随后，根据紫外吸收信号所显示的结果，合并含有TRPC3四聚体的峰组分。再次浓缩至最终浓度至少为5毫克/毫升。

人源TRPC3在临界胶束浓度为0.01至20微摩尔的一系列去垢剂中进行全细胞增溶，并在含有DDM/CHS的缓冲液中进行检测。尽管DDM/CHS对人源TRPC3的增溶效果最佳，但其洗脱峰位置过大，无法对应四聚体形式的人源TRPC3。全细胞增溶后，去除细胞裂解碎片，将增溶后的蛋白上样至SSC柱，并在含DDM/CHS去垢剂的缓冲液中进行HPLC分析，以在不同条件下比较人源TRPC3相对于TRPM4对照的绝对增溶度和洗脱峰体积。

所有不同去垢剂溶解的TRPC3样品均在约11.9毫升处出现洗脱峰，该位置可能过大，因为人源TRPC3的四聚体形式分子量小于阳性人源对照TRPM4。随后测试了两种含有DDM/CHS和皂苷的不同溶解与运行缓冲液。在含有皂苷的缓冲液中跑胶的蛋白样品，其洗脱峰位置相对于阳性对照更为合理，且峰高最高。

尽管使用25毫升细胞进行的小规模纯化显示出多个宽峰，但负染二维分类结果显示该蛋白具有单一人源TRPC3通道四聚体的特征。随后根据人源TRPC3的生理特性筛选添加剂。EDTA在稳定人源TRPC3处于完整四聚体峰位置方面表现出显著作用，显著增加了冷冻电镜显微照片中颗粒的数量，并降低了背景噪声。

最终结果的质量取决于在HPLC上对FSCC谱图进行良好的故障排查，以及快速完成所有纯化步骤，最好在一天内完成。在此过程完成后，可进行结构测定、抗体生成以及功能研究，如结合实验或电生理学分析。

该技术已被并可进一步适用于研究其他离子通道和蛋白质家族，以及制备可用于结构解析以外应用的纯化蛋白质。应采取适当的预防措施以管理细胞培养相关的生物危害，例如在超净工作台内操作、穿戴防护服，并妥善处理废弃物。