用于结晶的高效哺乳动物细胞表达及胞外糖蛋白单步纯化

该哺乳动物蛋白表达技术的总体目标是生产出毫克量级、天然折叠的蛋白质，适用于结构、生物物理及功能研究。该技术的主要优势在于，它是一种快速且简便的方案，可用于获得分泌型哺乳动物蛋白，并达到结构研究所需的纯度和浓度。通常我们发现，蛋白产量方面的问题大多与细胞的健康状况和活力有关。

通过密切监测细胞活力以及培养基中的糖含量，可显著提高蛋白产量并延长细胞的使用时间。监测细胞密度也非常重要。我们发现，如果在转染前任何时刻细胞密度超过每毫升200万个细胞，则蛋白产量将显著降低。进行293F细胞的大规模培养时，需在1升293F培养基中添加10毫升100倍浓度的谷氨酰胺和5毫升100倍浓度的青霉素-链霉素溶液。

在无血清条件下，抗生素的浓度已足够高，而降低抗生素浓度可在转染过程中提高细胞存活率，从而提升蛋白表达量。转染前一天，在标准组织培养孵育箱中，将 293F 细胞以 300 毫升培养基接种于 1 升聚碳酸酯带挡板锥形瓶（带通气盖）中，于 37°C、8% 二氧化碳条件下振荡培养。转染当天，将细胞稀释至密度为每毫升 50 万个细胞。通过加入占培养基体积 10% 的 2%（重量/体积）Cell Boost 添加剂，补充 293F 培养基。

在此步骤中加入卡夫（kafu）以控制蛋白质糖基化。在无血清培养基中制备DNA和转染试剂溶液，孵育5分钟。接着，将转染试剂以1毫升为增量逐次加入DNA溶液中，并充分混匀。

室温下轻轻孵育30分钟，使试剂与DNA复合物形成。然后将溶液逐滴加入细胞中，转染后的细胞表达蛋白72至96小时，以纯化糖蛋白。首先将培养液倾入离心瓶中，在1300 ×g条件下离心20分钟，使细胞沉淀。收集上清液，如有需要，可再次离心或使用0.22微米滤膜过滤，以澄清上清液。

接下来，加入10%体积的10×镍-硝酸盐上样缓冲液、三乙酸或镍-NTA结合缓冲液。然后在4°C条件下，将2毫升镍-NTA悬浊液加入层析柱中，制备重力柱，并用10个柱体积的1×结合缓冲液在4°C下进行平衡。将上清液流经树脂，并收集穿流液。

将上清液流穿液加入柱子后，用10个柱体积的洗涤缓冲液洗涤。然后用5个柱体积的洗脱缓冲液洗脱蛋白。如果需要进行去糖基化处理且最终体积为0.5毫升，则使用离心浓缩器将EIT浓缩至0.43毫升，并在16,000 ×g、4°C条件下离心，沉淀任何杂质。

然后加入 50 µL 的 500 mM 柠檬酸钠（pH 5.5）和 20 µL 的内切酶 HF。将混合物在室温下孵育两小时以去除内切酶 HF，首先用磷酸盐缓冲盐水将直链淀粉树脂洗涤三次。将蛋白与洗涤后的树脂在 4 °C 下孵育一小时。

孵育后，在1000 × g下离心5分钟，使树脂沉淀，收集上清液。使用适当截留分子量的离心过滤装置，将蛋白质浓缩并置换到所示的储存缓冲液中。以下是经镍亲和层析纯化后，氯霉素处理细胞中表达的分泌蛋白的代表性SDS-PAGE结果。

第一泳道为去糖基化前的蛋白质，第二泳道为经Endo HF酶切去糖基化后的蛋白质。糖基化蛋白的迁移位置约高出10千道尔顿，经一步纯化并去糖基化后，蛋白条带坍缩为单一清晰条带，其分子量与预测值一致。晶体筛选采用悬滴法进行。

上方图像显示了初始的晶体筛选结果，下方图像显示了优化后的结晶条件。这表明目标蛋白的生物化学均一性可能是决定结晶成功的关键因素，而优化的哺乳动物表达系统能够产生适合结晶的蛋白。经镍柱纯化的蛋白可进一步通过尺寸排阻色谱法进行纯化。

这一步骤对于评估蛋白质表达水平并优化条件以获得正确折叠的蛋白质也十分有用。目标蛋白质应为层析洗脱液中的主要组分，且其洗脱体积应与该蛋白质的分子量相符。若洗脱体积过早，则可能提示蛋白质发生聚集或错误折叠。一旦掌握该技术，便可实现稳定操作。

如果操作得当，该技术可在四天内完成。在进行此操作过程中，保持细胞培养的无菌条件至关重要。在完成此操作后，还可采用其他方法，如尺寸排阻色谱法、多角度光散射、差示扫描量热法和荧光测定法，以评估蛋白质的寡聚状态及其热稳定性。