松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus 交配行为的观察与量化

本实验的总体目标是观察松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）的交配行为。该方法有助于推进对线虫的心理学研究，尤其针对松材线虫的交配行为进行观察。

该技术的主要优势在于能够获得未交配的成虫，从而更便于观察成虫的交配行为。该技术的应用意义主要延伸至线虫的广泛研究领域，因为各类线虫具有相似的生活周期和行为特征。本方法的演示至关重要，因为获取未交配的成虫较为困难，这需要对发育阶段的线虫进行精确操作和经验积累，且在早期一龄幼虫阶段很难准确区分雄性和雌性个体。

为了培养松材线虫，首先准备马铃薯葡萄糖琼脂平板。接种时，从褐褶菌菌膜上切取直径为10毫米的菌块，置于新的PDA平板中央。将菌膜在25摄氏度避光条件下培养5天。

五天后，将松材线虫加入已准备好的培养皿中，在黑暗条件下于25摄氏度培养三天。为从真菌中分离线虫，首先准备收集工具。在漏斗下方放置一段夹紧的橡胶管，并将准备好的漏斗固定在支架上，组装成贝尔曼漏斗装置。

然后，在漏斗口放置两层滤纸代替纱布。将真菌培养物转移至该漏斗装置中，并加水直至真菌菌膜完全浸没。两小时后，线虫将从真菌培养物中逸出，穿过滤纸，最终沉降至贝尔曼漏斗的最底部。

将15毫升离心管置于漏斗下方，缓慢松开夹子，收集数滴含有线虫的水样。在室温下以3,000 G离心力离心线虫样品2分钟。然后吸除上层水相，将线虫重新悬浮于1毫升水中。

将线虫悬液转移至一个六厘米的玻璃培养皿中，并加入三毫升水，以帮助线虫自由游动。现在，收集卵以制备 virgin 群体。将培养皿置于暗培养箱中，让怀卵雌虫产卵10分钟。

由于卵具有糖蛋白表面，它们会黏附在玻璃上。接下来，小心移除含有线虫的水，以避免扰动黏附在培养皿上的卵。然后，迅速向培养皿中重新加入3毫升水，以防止卵干燥。

重复此卵清洁过程至少三次，以去除所有幼虫和成虫，获得纯净的卵。向洗涤后的纯净卵收集物中加入 5 毫升水，并在 25°C 黑暗条件下继续培养卵。卵培养开始 24 小时后，收集孵化出的 J2 幼虫。

小心地将J2幼虫转移至一个15毫升离心管中。然后在3,000 G条件下离心收集物2分钟。吸除上层水相，并重新加入200微升水。

然后，将 J2 幼虫接种于含有真菌菌丝垫的 PDA 平板上进行培养。培养 52 小时后，大多数 J2 幼虫将发育为早期 J4 幼虫阶段。组装贝尔曼漏斗装置，并按照前述方法从真菌培养物中提取线虫，持续两小时。

等待期间，准备一根用于挑取线虫的针。将玻璃毛细管的尖端在酒精灯上加热，拉出一个尖头。该尖头直径需约为 50 微米，大致相当于一条成年线虫的体宽。

两小时后，将 J4 期幼虫转移至洁净的培养皿中，操作方法如前所述。现在，在体视显微镜下对线虫进行性别鉴定。通常约有三分之二的幼虫为雌性。

雌性的阴门在解剖结构上明显不同于雄性，但由于线虫活动性很强，区分性别需要经过练习。本实验方案最关键的步骤是在第一阶段早期精确区分并分离雄性和雌性个体，否则一旦发育至成虫，将导致混合和不良结果。

这使得观察交配行为变得困难。逐渐挑选并转移线虫至载玻片上的水滴中，分别用于雄性和雌性。为确保成功，应由两位不同人员重复检查性别分配。

现在，将含有性分离线虫的水滴转移至合适的真菌培养皿中。随后，将处女虫再培养24小时，再观察其交配行为。为观察松材线虫的交配行为，首先准备多个凹面载玻片，向每个凹孔中加入200 µL的水。

接下来，挑选一只已准备好的未交配成虫，将其转移至已准备好的载玻片上。将未交配成虫置于孔内约一小时，使其适应新的水性环境。一小时后，使用移液器向孔内加入一只相反性别的未交配成虫。

然后，在体视显微镜下观察交配行为，并对行为进行录像，以便进行定量分析。整个交配过程通常在两小时内结束。每30分钟添加50 µL水，以补偿蒸发损失。

为研究交配选择与两性间竞争，将两种不同组合的未交配线虫进行分组并观察。未交配成虫的交配成功率约为87%，远高于随机选取的成虫。每对线虫完成整个交配过程平均耗时83分钟，该过程包含四个不同阶段。

寻找、接触、交配和逗留。在这些阶段中，可以观察到许多特定的行为模式。当一只雌性遇到多只雄性时，表现出明显的交配选择。

雌性通常用头部接触一只雄性，接触部位通常为头部、身体、尾部和生殖区域。随后，雌性会与该雄性交配，或迅速离开并游向另一只雄性。不同线虫组合的交配成功率在首次接触后进行测定。

也存在异性间的竞争行为。当一只未交配的雌性与三只未交配的雄性混合饲养时，雄性会尽可能地接近并接触该雌性，以争取与其交配的机会。当雌性的阴门被占据时，其他雄性会试图通过剧烈的身体摆动或拖拽的方式干扰交配过程，以期将正在交配的个体分开。

雌性个体间的性间竞争被发现与雄性个体间的性间竞争大体相似。由于性间竞争的存在，不同组合之间的交配频率存在显著差异。该技术建立后，为探索线虫的行为生态学开辟了道路。

一旦掌握，此操作若正确进行，可在12天内完成。在尝试此操作时，重要的是要准确地将雄性与雌性分开，并分离早期四龄幼虫以获得处女成虫。