RNA干扰技术在松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus 中的应用

RNAi 已成为鉴定线虫基因功能的有效方法，并被认为是一种有效控制致病性线虫的新途径。通过将线虫浸泡在双链RNA（dsRNA）中即可完成RNAi操作。首先，采用贝尔曼漏斗法收集线虫。

为此，将一段夹紧的橡胶管置于漏斗下方，并在漏斗口放置两层滤纸。将灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）真菌培养物转移至漏斗中，并加入水浸没菌丝垫。收集到线虫后，在一个2 mL离心管中加入500 µL提取试剂和100 µL磁珠。

吸取20微升线虫样品，在9,000 × g条件下研磨30秒。孵育5分钟后，在4°C下以12,000 × g离心10分钟。将上清液转移至新的离心管中。

加入100微升氯仿，通过反复倒置离心管进行混匀。室温孵育3分钟，然后在4摄氏度下以12,000 × g离心10分钟。再次将上清液转移至新的离心管中。

加入250 µL异丙醇，剧烈涡旋振荡。在12,000 × g条件下离心10分钟，然后涡旋振荡。弃去上清液，加入500 µL 75%乙醇洗涤RNA。

将样品涡旋振荡，随后在4°C条件下以12,000 × g离心5分钟。将RNA沉淀在空气中干燥5分钟，并用30 µL无RNase的水重悬。使用此公式计算RNA浓度，并计算A260与A280的比值。

接下来，使用一对引物从松材线虫（B.xylophilus）中扩增 BX ppm-1 基因的部分编码序列。然后将 ppm-1 基因序列克隆至含有 T7 启动子的 pGEM-T Easy 载体中。以克隆后的质粒为模板，通过 PCR 扩增回收长度为 894 个碱基对的 ppm-1 基因片段。

然后，使用体外转录试剂盒合成双链RNA。利用分光光度计分析双链RNA的质量，并在1%琼脂糖凝胶上对产物进行电泳检测。加入4微升5X浸泡缓冲液，再用双蒸水补足至20微升，使RNA终浓度为0.8微克/毫升。

然后将线虫放入培养皿中静置30分钟，等待卵附着于皿底。小心移除水和线虫，注意不要扰动卵，直至培养皿中仅剩卵。将收集的卵在25 °C避光条件下孵化24小时，以获得J2幼虫。

将幼虫收集到离心管中，用双蒸水洗涤三次。然后将幼虫转移至含有dsRNA溶液的离心管中。向其中加入间苯二酚溶液，使其终浓度为1%。

将幼虫置于摇床上，以确保dsRNA充分吸收进入幼虫体内。对照组则将相同数量的线虫浸泡在不含dsRNA探针或含有GFP dsRNA探针的浸泡缓冲液中。使用actB和tbb-2基因作为内参基因，进行qPCR以评估基因表达水平的变化。

利用溶解曲线和Ct值，采用ΔΔCt法估算基因相对表达水平。RNAi处理后，将J2幼虫在PDA平板上的灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）菌苔上培养至成虫。按照第一节所示方法，使用贝尔曼漏斗法收集成虫。

在显微镜下获取成年线虫的图像，并使用 ImageJ 软件测量 50 条雄性与 50 条雌性线虫的体长。通过计算每组样本的平均值和标准差来分析数据。采用 Student's t 检验比较不同组别样本均值之间的差异。

RNAi 后的相对基因表达分析表明，ppm-1 dsRNA 能有效抑制松材线虫 B.Xylophilus 中 ppm-1 基因的表达，而外源性 GFP dsRNA 对 ppm-1 的表达无影响。RNAi 处理后，尽管线虫仍能达到性成熟，但成虫体型显著减小，表现为小型体形突变表型。

突变型雌性和雄性线虫的平均体长分别为 544 和 526 微米，而对照组为 971 和 912 微米。最关键的是将线虫转移至双链 RNA 溶液中，并加入另一种试剂以刺激线虫摄食。该方法适用于大规模基因筛选，在细胞研究中被广泛使用。通过该方法研究松材线虫（B.Xylophilus）的基因功能，对其生物防治具有指导意义。