Staphylococcus aureus中水平基因转移研究的方法学

本实验的总体目标是提供一种详细的方法，用于研究金黄色葡萄球菌中DNA的水平转移，重点针对三种主要的转移途径：接合、转导和自然转化。该方法旨在研究人类病原体金黄色葡萄球菌中抗生素抗性基因的水平转移。

本文介绍的技术主要优势在于，我们可以检测三种主要的基因转移模式，包括最近发现的自然遗传转化。演示该实验步骤的是本实验室的博士研究生 Le Thuy。开始实验时，分别用含或不含 32 毫克/升氯霉素的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基，制备 5 毫升的供体菌和受体菌过夜培养物。

在37摄氏度下振荡培养。次日，用新鲜TSB培养基将过夜培养物的光密度调整至1。取0.5毫升供体培养物与0.5毫升受体培养物混合。

向混合物中加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。然后使用真空泵系统，将细菌混合物转移至0.45微米滤膜上。将滤膜置于羊血琼脂平板上。

将培养皿在 37 摄氏度下孵育一天。从培养皿中取出滤膜，并将其悬浮于 10 毫升 PBS 中。涡旋混合约一分钟，以收集附着在膜上的所有细菌。

用新鲜的TSB对细菌悬液进行10倍系列稀释。取0、10、4稀释度的样品各100微升，接种于TSB琼脂平板上。或者接种于添加了32毫克/升氯霉素和8毫克/升四环素的TSA平板上，以筛选接合子。

将稀释后的菌悬液各取100微升涂布于含8毫克/升四环素的TSA平板上，以计数受体菌总数。培养后，通过菌落PCR检测双重耐药菌落中CFR基因的存在情况，并分析其药敏谱型。

根据标准的微量稀释法或纸片扩散法，测定适当抗生素的最小抑菌浓度（MICs），以确定抗菌谱。接合子的敏感性谱必须与受体菌株相同，但氯霉素及其他受CFR基因影响的化合物除外。

为了排除供体菌株产生的四环素抗性，用含有 3.6 毫摩尔钙的 5 毫升营养肉汤制备 N315-45 的过夜培养物。将过夜培养物按 1:1,000 的比例稀释，最终体积为 10 毫升，分装至 50 毫升玻璃试管中制备亚培养物。

在37摄氏度、180转/分钟振荡条件下培养细菌1小时。随后，在NB氯化钙培养基中制备一系列稀释的噬菌体MR83a。取20微升稀释后的噬菌体加入细菌培养物中。

制备未感染噬菌体的对照培养物，作为细菌细胞生长的阳性对照。随后将培养物在37摄氏度、100转/分钟的轻柔振荡条件下过夜培养。次日，选择一至两个噬菌体稀释度最高且培养液最澄清的培养管。

将培养物转移至15毫升离心管中。向管中加入250微升氯仿，通过倒置充分混匀培养物。在4摄氏度下，以5,000 × g离心20分钟。

将上清液转移至新的离心管中，并在4摄氏度下保存备用。制备营养肉汤琼脂培养基，并将其置于55摄氏度水浴中保温。向培养基中加入经高压灭菌的0.5摩尔氯化钙溶液，使其终浓度为3.6毫摩尔。

将其倒入90毫米的NB氯化钙培养皿中。在37摄氏度、摇床条件下，用5毫升NB氯化钙培养基培养N315过夜培养物。次日，取10微升过夜培养物加入200微升NB氯化钙培养基中，均匀涂布于NB氯化钙平板上。

当培养皿表面被液体覆盖时停止涂布，随后将培养皿静置干燥五分钟。使用NB氯化钙培养基对先前制备的噬菌体进行10倍系列稀释。

将每种噬菌体稀释液各取三微升点样到涂有细菌的平板上。在30摄氏度下过夜培养平板。次日早晨，计数噬菌斑数量，并使用以下公式计算噬菌体滴度。

在37摄氏度、180转/分钟振荡条件下，于5毫升含氯化钙的营养肉汤中培养N315、COL或MU50过夜培养物。过夜培养后，将噬菌体用含氯化钙的营养肉汤稀释至10⁹ PFU/毫升。在50毫升玻璃小瓶中，混合500微升过夜培养物、500微升新鲜含氯化钙的营养肉汤和1毫升浓度为10⁹ PFU/毫升的噬菌体。

将混合物在37摄氏度下以每分钟100转的温和振荡孵育30分钟。孵育结束后，向培养物中加入50微升20%的柠檬酸三钠。继续在37摄氏度下以温和振荡处理30分钟。

制备融化的脑心浸液或 BHI 琼脂培养基，置于 55 摄氏度水浴中保温，并用终浓度为 32 毫克/升的氯霉素处理琼脂培养基。然后将细菌与噬菌体混合物转移至 100 毫升锥形瓶中，加入 50 毫升含有 32 毫克/升氯霉素的温热 BHI 琼脂，充分混匀。

将混合物倒入90毫米的培养皿中。在37°C条件下培养平板。通过将生成的菌落（即转导子）转移至添加了32毫克/升氯霉素的新的BHI琼脂平板上，检测其抗性。

通过菌落PCR确认CFR基因的存在。将受体细胞在37摄氏度、5毫升TSB培养基中振荡培养过夜。次日早晨，取0.5毫升过夜培养物转移至1.5毫升离心管中。

通过离心沉淀细胞。然后在50毫升离心管中用10毫升CS2培养基重悬细胞。接着在37°C、180 rpm振荡条件下培养细菌8小时，直至进入对数生长后期。

通过离心收集细胞。弃去上清液，并将细胞重悬于10毫升新鲜CS2培养基中。向细胞悬液中加入10微克纯化的质粒或基因组DNA。

以每分钟180转的速度振荡培养物。然后通过离心收集细胞。将细胞重悬于10毫升BHI培养基中。

将细胞悬液与90毫升已融化并添加32毫克/升氯霉素和5微克/升四环素的BHI琼脂混合（对照实验）。将混合物倒入90毫米的培养皿中，迅速冷却并使琼脂凝固。使用牙签将菌落转接到含有相应抗生素的平板上进行复制，以确认其抗性特征。

该接合转移实验方案适用于种内转移，其中以表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）作为CFR供体，金黄色葡萄球菌N315菌株作为受体。在种间转移中，使用相同的接合质粒载体及不同的接合供体菌株，亦可获得类似结果。

这是首篇描述自然转化细节的论文。所提供的方法将有助于研究人员研究抗生素耐药性的传播机制，以及人类病原体金黄色葡萄球菌中的主要决定因素。