检测实验方案 蓝细菌 使用抗体微阵列芯片检测液态和固态样品

本实验的总体目标是利用荧光微阵列免疫分析法检测液体和固体样品中多种蓝藻菌株的存在。该方法有助于回答环境监测和水资源管理领域中的关键问题，例如在藻华尚不可见于肉眼之前，检测产毒前体毒素细菌的存在。该技术的主要优势在于，可在三至四小时内同时检测多种蓝藻菌株和多个样品，既可在现场也可在实验室中进行。

因此，该方法可为生物多样性研究提供见解，也可应用于其他领域，如农业设施监测、极端环境中的生命探测或行星探索。通常，初次接触该方法的人员不会遇到困难。

由于样品处理简单且结果易于解读。根据文本方案制备并纯化抗体后，向含有标记染料的商用小瓶（含一毫克蛋白质）中加入100微升DMSO。待染料溶解后，向每50微升抗体溶液中加入2微升染料，对纯化的抗体进行标记。

将标记反应在室温下置于振荡平台上持续振荡孵育一小时。根据文本方案纯化标记后的抗体，取少量样品加入分光光度计，测定280和650纳米处的吸光度。按照供应商的建议计算标记效率。

制备CYANOCHIP时，将每种纯化抗体与蛋白打印缓冲液（1X）和体积分数为0.1%的Tween 20混合，配制成终浓度为每毫升含1毫克抗体的溶液，每种抗体准备30微升。同时准备以下打印溶液作为对照，每种30微升：含体积分数0.1% Tween 20的1X蛋白打印缓冲液。

将每种蛋白A纯化的前免疫血清以1毫克/毫升的浓度溶于含0.1% Tween 20的1×蛋白打印缓冲液中，并加入1毫克/毫升BSA。将上述制备好的打印溶液每孔30微升加入高质量384孔微孔板中。根据文本方案设置好打印机器人和载玻片基底后，将所有抗体及对照以三份重复的点样模式点样至载玻片上，点样直径约为180至200微米。

在环境采样时，使用无菌注射器收集1至100毫升液体，并通过孔径为3微米的滤膜过滤样品以浓缩细胞。如有需要，可从岩石或土壤中采集固体样品，并将其保存在无菌试管中。样品可在小型野外实验室中进行检测。

加入1毫升提取孵育缓冲液以回收滤膜上收集的生物量，并使用刮勺将滤膜刮入15毫升离心管中。使用手持式超声处理器，或通过反复吹打数次，使该聚集体充分混匀并均质化。此外，在另一个10毫升离心管中称取最多0.5克的固体样品，并加入最多2毫升提取缓冲液。

将超声探头浸入试管中，使用手持式超声处理器或其他超声设备进行超声处理。在保持样品处于冰浴的同时，以30千赫兹频率至少进行五个30秒的超声循环，每次超声之间间隔30秒。为制备免疫测定用的滤液提取物，使用10毫升注射器连接孔径为5至20微米的尼龙滤膜过滤装置，将溶液过滤至1.5毫升离心管中，以去除沙粒、黏土及其他粗颗粒物质。

将芯片点阵面向下，将玻片置于100至200微升封闭液液滴上，孵育3至5分钟。使用塑料尖头镊子，避开芯片区域，小心夹起玻片。将玻片浸入新鲜封闭液中，在轻微振荡条件下孵育30分钟。

为干燥载玻片，将其放入适用于显微镜载玻片的离心机中短暂离心。按照试剂盒说明书，将载玻片放入一个 3×8 孔的微阵列杂交盒中。或者，在修改抗体点样模式后，可使用定制的杂交盒（例如此处所示的杂交盒），也可直接使用盖玻片进行装置。

在完成载玻片和样本盒的组装后，将每种样品提取物或其在提取孵育缓冲液中的稀释液最多50微升，用移液器加入样本盒的每个孔中。或者，可将样品加载到其他孵育装置中，或直接使用盖玻片。作为阴性对照，向样本盒中至少两个独立的孔内各加入50微升TBSTRR缓冲液。

将样品在室温下孵育一小时，每15分钟用移液器吹打混匀一次；或者在4摄氏度下孵育12小时。洗涤微阵列时，将卡盒倒置，轻轻在洁净的吸水纸上轻拍。然后向每个孔中加入150 µL提取孵育缓冲液进行洗涤，并像之前一样通过在吸水纸上轻拍去除缓冲液。

重复洗涤三次。向每个孔中加入50 µL含有17种抗蓝细菌菌株抗体的荧光抗体混合物。将样品在室温下孵育1小时，或在4°C下孵育12小时。

洗涤芯片时，小心将芯片盒平放，轻轻在干净的吸水纸上轻拍。然后加入150微升提取孵育缓冲液，再通过在纸巾上轻拍去除缓冲液。重复洗涤三次。

然后拆卸玻片盒，将玻片浸入0.1X PBS溶液中快速漂洗。同前快速离心以干燥玻片。使用荧光扫描仪，在远红荧光染料的最大发射峰处扫描玻片的荧光信号。

通过改变增益值，以不同的扫描参数对微阵列进行多次成像。最后，加载网格，根据文本方案对数据进行定量、处理和分析。本视频中展示的CYANOCHIP多重免疫测定法用于同时鉴定本表所列的最重要淡水蓝藻物种。

采集自淡水水库岸边的水样通过微阵列检测法进行了分析。主要的阳性免疫反应对应于浮游性蓝藻微囊藻属（Microcystis）和底栖性蓝藻Leptolyngbya属的抗体。对于浮游性的念珠藻目（Nostocales）中的Aphanizomenon属、Anabaena属、微囊藻（Microcystis flos-aquae）以及底栖性Rivularia属，获得的荧光信号较弱。

还通过检测南极干燥微生物垫来验证该微阵列，以测试是否存在蓝细菌标记物。抗体对底栖蓝细菌、鱼腥藻属（Anabaena species）和细鞘丝藻属（Leptolyngbya species）产生了阳性反应。使用针对浮游蓝细菌的抗体还检测到额外的阳性免疫反应，例如微囊藻属（Microcystis species）、束丝藻属（Aphanizomenon species）和红环丝藻（Planktothrix rubescens species）。

最后，这些信号来自针对其他底栖物种的抗体，包括束丝藻属（Tolypothrix species）和鱼腥藻属（Anabaena species）的抗体。一旦掌握该技术，若操作得当，排除抗体制备和平衡步骤，整个过程可在三到四小时内完成。通过同时孵育样品与荧光标记抗体，可节省约一小时时间。

在进行这些操作时，重要的是要记住将荧光抗体混合物配制好，并确保抗体处于其最佳工作稀释浓度。完成这些步骤后，还可采用其他方法，如光学显微镜观察、DNA提取及特异性PCR扩增，以回答更多问题，例如土壤中的浓度或确认所检测到的菌株类型。该技术建立后，将为环境监测领域的研究人员探索水体、双培养过程、淡水管理或微生物生态学研究提供新的途径，而无论样品类型如何。

观看本视频后，您应能够充分理解如何使用荧光标记抗体、操作抗体微阵列、进行多重免疫测定，以及分析和解读微阵列免疫测定结果。请务必注意，超声操作可能存在危害，在执行这些实验步骤时，应始终采取预防措施，例如佩戴听力保护装置或其他特定防护措施。