出生后小鼠听泡的解剖：中耳听小骨的分离与组织学分析

解剖操作的总体目标是从新生小鼠中分离出听泡和耳囊，进而分离单个听小骨，用于各种整体染色及组织学分析。该方法可用于研究创伤生物学领域中的关键问题，例如形态发生障碍、软骨内成骨或矿物质代谢异常的机制。该方法基于对解剖学细节的深入理解。

通常，对于刚接触小鼠这一生物系统的研究人员来说可能会遇到困难，因为他们对人体中耳的了解可能并不适用于小鼠。本操作将由本实验室的技术员 Ayako Sakamoto 演示。首先，将听泡及周围带有颅骨的骨 capsule 置于盛有室温 pH 7.4 磷酸盐缓冲液的样本皿中。

在双目解剖显微镜下，辨认出围绕听囊的颅骨骨片，如图所示。使用一套镊子夹住周围的颅骨，用另一套镊子移除基枕骨和枕骨。然后用镊子轻轻将间顶骨和顶骨从听囊上拉开，并在完全松动后将其去除。

接下来，将鳞状骨从鼓室和囊状结构上拉开，并轻轻剥离周围的骨组织和软组织。然后，握住外耳，将标本翻转以显露内侧。接着，将标本旋转180度，抓住囊状结构，并将残留的软组织拉离。

背侧嵴现已可见。从该角度可清晰观察到内听道、下弧形窝以及前半规管中的面神经和前庭蜗神经。当背侧嵴朝向解剖皿底部倾斜时，听泡清晰可见。

如果制备位置稍有倾斜，则可在鼓室内看到锤骨。首先使用镊子在锤骨上方及鼓沟外侧处折断外耳道。在第一处骨折前方再制造第二处骨折。

然后去除外耳道部分组织，使鼓膜可见。接着，去除鼓膜的一部分以及位于锤骨短突附近的腹侧和后侧鼓骨部分。此时，锤骨、砧骨、镫骨以及鼓膜张肌应已暴露。

抬起锤骨，用27号针头的斜面边缘切断鼓膜张肌。注意锤骨柄牢固地附着于鼓膜，这与其他哺乳动物中的情况相似。通过在鼓索骨处折断锤骨的前突，使锤骨在听小骨关节处与砧骨分离。

使用镊子从听泡中分离锤骨。去除听泡的大部分组织，以暴露砧骨和镫骨。然后使用27号针头的斜面边缘在短嵴处切断砧骨的后韧带。

使用镊子分离砧骨。用27号针头的斜面在靠近镫骨处切断镫动脉。旋转样本，使圆窗位于底部。

然后将一根缝纫针插入镫骨的前庭窗孔（obturator foramen），并抬起镫骨。移除镫骨后，应清晰可见卵圆窗的开口。使用27号针头将镫骨从缝纫针上推下。

开始组织包埋时，首先用剪刀切除鼓泡前部的针状突。通过切口处可观察到锤骨和背侧嵴。将鼓泡及囊泡浸入含1-2%多聚甲醛的PBS溶液中。

如果鼓泡内有空气滞留，需使用针头和注射器将其排出。将鼓泡及其囊膜置于4摄氏度的固定液中，在试管旋转仪上过夜固定。次日，用PBS快速冲洗鼓泡及囊膜。

然后立即浸入4°C的液态冷冻包埋剂中。冷冻包埋剂中常在中耳和外耳水平形成气泡。通过针头抽吸去除中耳中的气泡。

对外耳中的气泡采用相同的技术处理。待所有气泡完全排除后，根据所需切片类型对组织进行定向。随后可将组织包埋于冷冻块中，以备切片。

该图像显示了P14小鼠脱钙锤骨（以字母M表示）以及听泡和囊的纵向石蜡切片的H和E染色结果。鼓膜由字母TM表示。该图像还显示了P21小鼠未脱钙锤骨（以字母M表示）以及听泡的纵向冷冻切片的钙骨标记结果。钙绿信号揭示了锤骨、听泡和囊中的新骨形成。

一旦掌握了该技术，若操作得当，可在十分钟内分离出听泡和囊状结构。观看本视频后，您应能充分理解小鼠听小骨及听泡的解剖学方位，相关内容已在正文部分进行描述。