C57BL/6小鼠的耳蜗植入手术及电诱发听觉脑干反应记录

耳蜗植入物的动物模型有助于增进我们对利用电刺激治疗永久性感音神经性听力损失的技术基础的理解。本方案展示了小鼠的急性致聋与耳蜗植入手术，以及通过听觉脑干反应对耳蜗植入刺激进行的功能性评估。

在小鼠中进行耳蜗植入手术的一些主要挑战在于耳蜗体积较小，以及圆窗龛附近存在较大的镫骨动脉。为测量正常听力状态，将声学泡沫装入1毫升注射器中，向一只8至12周龄的C57 black 6小鼠的对侧耳道内注入100至200 µL泡沫，以隔离同侧耳的听觉脑干反应，注意注射器应紧密封闭耳道，确保泡沫完全注入耳道深处。接着，将扬声器置于同侧耳10 cm处，并用70%乙醇清洁aVR电极。

将参考电极置于同侧耳廓下方的皮下，活动电极置于头顶皮下。将接地电极置于后肢的皮下。通过光纤接口将头戴式放大器和前置放大器连接至听觉处理器。

检测有源电极和参考电极的阻抗。当电极显示的阻抗相同时，关闭隔音室并给予咔嗒声刺激。在自由场条件下，使用适当的复杂听觉处理器和软件记录 aVR。

将点击刺激标准化为单通道单相脉冲，脉冲时长0.1毫秒，以21赫兹频率呈现，声压级从90分贝逐步降低至10分贝，每次递减10分贝，记录时间窗为10毫秒。随后确定aVR阈值，即能够识别出明显aVR波反应的最低分贝水平。为诱导耳聋，将小鼠置于右侧体位，注意保持身体平直，以确保气道通畅。

剪除同侧耳后方的毛发，并依次使用70%乙醇溶液和聚维酮碘溶液擦洗暴露的皮肤进行消毒。将动物置于解剖显微镜下，使用16倍物镜和手术刀在耳后做一至一点五厘米的切口。在25至40倍放大倍数下，用镊子钝性分离暴露的皮下脂肪层，并牵开胸锁乳突肌，以暴露鼓泡骨膜。

面神经绕过胸锁乳突肌后背侧边缘，并沿耳道向耳廓方向前行。以面神经作为识别听泡的解剖标志，轻柔地将自持式牵开器置入切口，以暴露听泡。清除覆盖在听泡内背侧区域的组织，清晰显露听泡与乳突之间的骨嵴，并将一根30号针头轻轻旋转刺入听泡，于骨嵴后上方位置钻出一个小孔。

用尖头镊子夹住小块骨片，扩大耳蜗开窗，直至暴露中耳腔。然后将孔向后上方延伸至乳突，直至圆窗龛上方的骨质完全清除。最关键的步骤是制备圆窗龛。

操作时务必小心谨慎，以免损伤镫骨动脉。在避免损伤镫骨动脉的前提下，向前上方扩大耳囊开窗，以暴露与卵圆窗相连的中耳听小骨——镫骨。随后去除镫骨，以暴露卵圆窗。

为了施加耳毒性药物，使用钝化的30号针头轻轻穿刺圆窗和卵圆窗膜，确认有外淋巴液流出。然后使用装有30号针头的1毫升注射器，通过卵圆窗缓慢灌注0.2毫升含5%（重量/体积）新霉素的PBS溶液。当全部药液注入后，将溶液大量灌入圆窗，注意避免损伤窗部的骨性结构。

将浸泡过新霉素的1平方毫米大小的明胶海绵块分别置于圆窗和卵圆窗凹陷处。然后撤去牵开器并缝合切口，并在30分钟后记录植入后的耳蜗前庭诱发肌源性电位（aVR）结果。为插入人工耳蜗电极阵列，需将牵开器重新置入切口以再次暴露鼓室，将电极阵列插入鼓阶，插入深度应使阵列的第四个铂金环恰好位于圆窗内侧。

电极阵列的插入也可能具有挑战性。因此，请耐心使用一把镊子引导导线，另一把镊子插入阵列，以找到合适的插入角度。将导线在鼓室内盘绕，并用胶水将导线固定在鼓室上方的组织上。

仔细移除牵开器，用组织胶封闭插入部位后，使用手术刀在颈部做一处0.5毫米的切口，切口方向垂直于即将放置有源电极和参考aVR电极位置之间的连线。将接地球电极置入切口，并将电极阵列板连接至动物刺激平台。为执行电aVR操作，请按照先前演示的方式放置电极，并打开动物刺激平台软件。

然后定义电脉冲刺激范式，并通过TBT前置放大器、前置放大器和听觉处理器连续记录经电脉冲刺激诱发的aVR反应。术前和术后听力阈值可作为耳聋处理效果的功能性读数。在卵圆窗和圆窗局部应用5%新霉素可显著提高点击诱发的听力阈值。

耳聋后对耳蜗内电极进行电刺激，可稳定地诱发电刺激性 aVR 活动。在某些情况下，人工耳蜗刺激会激活面神经，产生高幅波形，其潜伏期较短者约在三毫秒左右，表现为 Wave III 迅速增强，可能为面神经的直接反应；而潜伏期较长者出现在五至六毫秒左右，可能为面神经间接诱发的非听觉性肌源性反应。本研究证实，尽管人工耳蜗体积较小且手术难度较高，小鼠人工耳蜗植入模型仍具有可行性。

在进行该操作时，重要的是要考虑采用一种严格的方案，以消除aVR记录中的任何电声反应，并模拟大多数人工耳蜗使用者中存在的毛细胞丧失情况。总之，随着人类耳聋的遗传模型数量不断增加，以及小鼠中可用的生物医学工具日益丰富，小鼠已成为包括人工耳蜗研究在内的相关工具研究中极具吸引力的动物模型。