从人多能干细胞定向分化原始和确定型造血祖细胞

本方法的总体目标是利用特定阶段的信号调控策略，引导人多能干细胞向原始型或定型造血程序分化。该方法可解决该领域内的诸多关键问题，例如解析人定型造血过程中信号通路与转录调控因子的作用机制。该技术的主要优势在于能够实现对特定发育阶段的即时信号干预。

演示该实验步骤的是我实验室的博士后研究员 Carissa Dege。开始实验前，获取先前准备好的人多能干细胞系（HPSCs），这些细胞已在含有5% CO2的37°C培养箱中，于小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上培养至70%至80%融合度。吸除HPSC培养基，每孔加入1毫升37°C预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，作用1分钟。

一分钟后，吸除胰蛋白酶，并向每孔加入一毫升培养基。使用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下。然后，向每孔加入一毫升洗涤缓冲液。

使用2毫升血清移液管将细胞吹打3至5次，以分散大的细胞团块，然后将细胞转移至50毫升锥形管中。在330 × g离心5分钟以收集人多能干细胞（HPSCs）。

离心后，加入 HPSC 培养基并重悬细胞。接着，将 2 毫升重悬的 HPSC 加入 MAT 编码塑料器皿的每孔中，并将细胞在培养箱中孵育过夜。24 小时后，吸去培养基，更换为 37 摄氏度的 0.05% 胰蛋白酶 EDTA，作用 1 分钟。

吸出胰蛋白酶EDTA。加入一毫升培养基，用细胞刮棒剧烈刮取细胞。然后加入一毫升洗涤培养基。

用一支2毫升的血清移液管将细胞吹打重悬3次，然后转移至50毫升锥形管中。以220 × g离心5分钟。随后吸除上清液，加入20毫升洗涤培养基，并用5毫升血清移液管轻轻重悬细胞。

离心和吸除上清后，用第零天培养基小心地重悬拟胚体（EBs）。使用10毫升血清移液管，将含有拟胚体的2毫升分化培养基加入六孔低黏附细胞培养板的每个孔中。将拟胚体置于37摄氏度、5% CO2、5% O2的多气体培养箱中培养。

24 小时后，加入 2 毫升第一天培养基。将细胞在多气体培养箱中过夜孵育。18 小时后，用 5 毫升血清移液管轻轻收集胚胎小体（EBs），并在 100 × g 下离心 5 分钟。

用十毫升伊氏改良杜尔贝科培养基（Iscove's Modified Dulbecco Medium，IMDM）洗涤并重悬整个培养物。再次以100 × g离心5分钟以去除碎片后，吸除上清液。使用P1000移液器用第2天培养基轻柔地重悬拟胚体（EBs）。

然后将每孔2毫升的拟胚体加入至6孔低黏附细胞培养板中。分别加入3 µM的CHIR99021或IWP2，以定向诱导生成定型性或原始造血祖细胞。将培养板置于37°C多气体培养箱中孵育30小时。

30小时后，用2毫升血清移液管将EBs转移至50毫升锥形管中，于330 × g离心5分钟以收集EBs。轻轻重悬EBs，并用10毫升IMDM洗涤一次。将EBs重悬于第3天培养基中，每孔加入2毫升至低黏附性6孔板的各孔中。

将细胞置于37摄氏度的多气体培养箱中培养72小时。培养72小时后，向每个孔中加入2毫升第六天培养基。然后将拟胚体在37摄氏度的多气体培养箱中继续培养48小时。

在分化第8天分离经CHIR99021处理的EBs，并进入下一环节。以330 × g离心EBs 5分钟。吸除上清液。

接着向EBs中加入2毫升0.25%胰蛋白酶EDTA。将EBs涡旋5秒，并在37摄氏度水浴中孵育8分钟。然后加入5毫升终止液，并离心EBs。

然后吸除上清液。用5 mL胶原酶II重悬EBs。涡旋振荡管子5秒，随后将EBs置于37°C水浴中孵育。60分钟后，再次涡旋振荡EBs 5秒，并加入5 mL终止液。

离心后，吸除上清液，并将细胞重悬于1毫升FACS缓冲液中。通过40微米细胞筛网过滤细胞，以去除未解离的细胞团块。随后进行抗体标记，并对CD34阳性造血内皮前体细胞进行FACS分离。

流式细胞分选分离后，将细胞重悬于HE培养基中。将细胞以每孔50微升的体积分配至96孔低吸附培养板中，随后将细胞过夜培养。次日早晨，造血祖细胞应聚集成由6至10个细胞组成的细胞团。

将50 µL重聚集的细胞轻柔地转移至24孔MAT编码板的中央。将培养板轻柔地放入多气体培养箱中，孵育4至6小时，直至细胞贴壁。4至6小时后，待细胞贴附后，向每孔缓慢加入1 mL freshly prepared HE培养基。

将细胞置于多气体培养箱中孵育，直至观察到造血细胞。随后，通过轻轻移除细胞上的HE培养基，并经40微米细胞滤筛过滤以收集滤过液，从而收获定型造血祖细胞。对于剩余的贴壁细胞，加入0.5毫升0.25%胰蛋白酶EDTA溶液，于37°C培养箱中孵育5分钟。

胰酶消化后，向每孔加入 0.5 毫升终止液。将细胞通过相同的 40 微米细胞筛网，以汇集所有贴壁和非贴壁细胞，并离心收集细胞。将 2,000 至 10,000 个经 FACS 分选的细胞加入含 OP9 培养基的一孔 OP9 DL4 细胞中。

在37摄氏度、5% CO2培养箱中孵育。每四至五天传代一次，用1毫升移液器吹打细胞，经40微米滤网过滤以去除细胞团块。

离心后，吸除培养基。用2毫升新鲜T细胞培养基重悬细胞，并将其接种至新鲜的OP9 DL4细胞上。经过至少21天的低温培养后，剧烈吹打细胞，然后通过40微米滤膜过滤，以去除细胞碎片。

以330 × g离心5分钟，吸除上清液，然后继续进行标准流式细胞术分析。流式细胞术结果显示，IWP2处理的分化培养物产生明显的CD34阳性、CD43阴性以及CD34低表达CD43阳性细胞群；而CHIR处理的分化培养物在分化第8天时，CD43阳性细胞比例不足1%。

在IWP2条件下培养第9天分离得到的原始造血祖细胞，在甲基纤维素集落形成实验中主要产生原始红系和髓系祖细胞。由CHIR99021处理获得的CD34阳性CD43阴性细胞群体为异质性群体，包含内皮祖细胞以及CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性、CD184阴性的生血内皮细胞。该群体经FACS分选后，最初形成一层内皮样细胞单层，随后经历内皮向造血转化过程，产生圆形、折光性强、非贴壁的造血细胞。这些造血细胞可通过流式细胞术检测CD34和CD45的表达情况。

从EHT实验中分离得到的造血祖细胞可用于甲基纤维素集落形成实验，能够产生大型爆裂样红系集落形成单位、小型红系集落形成单位以及髓系祖细胞。这些代表性的流式细胞术分析结果展示了由CHIR99021诱导产生的CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性、CD184阴性造血祖细胞，以及由IWP2诱导产生的CD34阳性、CD43阴性造血祖细胞在T淋巴细胞分化潜能方面的表现，结果显示CHIR诱导的祖细胞中存在CD45阳性、CD56阴性、CD4阳性、CD8阳性细胞群，表明输入的CD34阳性细胞群体具有造血分化潜能。观看本视频后，您应能够充分理解如何将人多能干细胞分化为原始或确定型的造血祖细胞。