利用定义明确的分化系统从多能干细胞诱导肝祖细胞分化

本方案提供了一种源自干细胞的肝向分化系统，为肝脏生物学的基础研究和临床研究提供了可重复的工具。通过结合标准化且易于操作的实验流程以及市售培养试剂，该系统可实现肝前体细胞和类肝细胞的大规模生产。将人多能干细胞接种于含层粘连蛋白-531的10厘米培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，每日每皿加入10毫升干细胞维持培养基进行换液。

为制备层粘连蛋白521包被板，将解冻的层粘连蛋白521用含钙和镁的预冷DPBS稀释至终浓度为8 µg/mL。向24孔板的每孔中加入250 µL层粘连蛋白溶液，或向96孔板的每孔中加入50 µL。轻轻左右摇动培养板以使溶液均匀覆盖孔底，然后用半透明柔性封板膜密封，并于4°C下过夜保存。

在细胞接种当天，将预先包被的培养板置于细胞培养箱中预热30至60分钟。吸除层粘连蛋白521溶液，每孔加入含有10 µM ROCK抑制剂的干细胞维持培养基，然后将培养板放回培养箱。当细胞融合度达到70%至80%时，吸除培养皿中的废弃培养基，并在室温下用5 mL不含钙和镁的DPBS洗涤每个培养皿。

吸出培养皿中的 DPBS 洗涤液，然后向培养皿中加入 5 毫升无酶解离试剂，在 37 摄氏度孵育 8 至 10 分钟，直至细胞明显从培养皿上脱落。用细胞刮轻轻刮下细胞，再用 5 毫升血清移液管将每孔中的液体上下吹打数次，以获得单细胞悬液。对于每种细胞系，将所有维持培养孔中的细胞汇集至一个无菌的 50 毫升离心管中。

用5毫升干细胞维持培养基清洗每个已弃去培养物的培养皿，并将清洗液加入含有混合细胞的相应离心管中。对每份混合样品进行三次活细胞计数。将混合样品在250 × g下离心5分钟。

然后吸除上清液，并将细胞重悬于1至3毫升室温的干细胞维持培养基中，培养基中需添加10 µM ROCK抑制剂Y27632。根据所需接种密度计算所需的细胞数量后，将细胞调整至适当浓度，并接种至预先包被的培养板中。24孔板每孔总体积应为1毫升，96孔板每孔为0.1毫升。

轻轻左右及前后摇动培养板，以确保细胞均匀分散，并将接种好的培养板放入培养箱中，继续前后及左右摇动。按照文稿中所述方法，准备用于定型内胚层诱导以及后续肝祖细胞特化分化的培养基。在分化第一天，吸出孔中的耗尽培养基，更换为第一阶段培养基一。

在第二天、第三天和第四天，吸除用过的培养基，并向每孔加入第一阶段培养基二。第五天，固定用于定型内胚层分化分析的孔；对于其余的孔，吸除用过的培养基，并向每孔加入干细胞分化肝祖细胞培养基。

第10天，收获细胞用于肝前体细胞分化分析，或继续进行肝样细胞的进一步分化。为表征肝前体细胞分化培养物，可在第5天通过免疫染色检测定型内胚层特异性标志物的表达，在第10天检测肝前体细胞特异性标志物的表达，并定量分析HNF4α阳性细胞所占百分比。在第10天，还可通过ELISA检测甲胎蛋白（alpha fetoprotein）和白蛋白的分泌水平。

本方案用于从人类胚胎干细胞和人类诱导性多能干细胞分化肝前体细胞。在分化方案的第5天，通过Sox17表达评估定型内胚层的特化情况。在两种细胞系中，Sox17均高度表达，H9和P106细胞系Sox17阳性细胞比例分别为80%和87.8%。

第10天时，肝前体细胞呈现鹅卵石样形态。此外，通过检测HNF4 alpha、AFP、白蛋白和细胞角蛋白19的表达来评估肝前体细胞的特化情况。两种肝前体细胞培养物均表达胎儿肝细胞标志物，如HNF4 alpha、AFP和CK 19。

在第10天，两种细胞系中均检测到甲胎蛋白的分泌，而通过ELISA未检测到白蛋白的分泌。通过定量HNF4α的表达来评估细胞数量的变异性及肝祖细胞的分化效率。在第10天，肝祖细胞在各孔间的变异性无显著差异，H9和P106细胞系每孔中HNF4α阳性细胞比例分别超过95%和97%。

在诱导分化开始前，确保细胞分布均匀是获得均一肝前体细胞群体的关键。为实现这一点，需轻轻左右及前后摇动培养板，以保证细胞均匀分散。本方案所产生的肝前体细胞可进一步分化为肝细胞样细胞，用于其他检测，为疾病建模或药物筛选提供一种可重复且标准化的工具。