人多能干细胞向造血内皮细胞的定向分化

本方案详细描述了一种生成特征明确的人源生血内皮细胞群体的方法。这些细胞可用于研究分子调控机制以及内皮向造血的转变过程。首先，将人胚胎干细胞培养四天，使其分化为原始内皮细胞。

第五天，吸除细胞上方的培养基。然后每孔用一毫升 DMEM/F-12 轻轻洗涤细胞。每孔加入一毫升 freshly prepared 血源性内皮细胞分化培养基，在 37°C 和 5% CO₂ 条件下继续培养细胞 24 小时。

在第六天和第七天，将每孔细胞上方的培养基更换为1毫升新鲜配制的同源内皮细胞分化培养基，继续培养细胞24小时。第八天，在消化并洗涤细胞后，将细胞均匀分装至预冷的微量离心管中，每管至少含有600 µL细胞悬液，细胞密度为1 × 10⁵ 个细胞/毫升。

根据需要向含有细胞的试管中加入抗体，置于冰上避光孵育30分钟。在4°C条件下以1000 × g离心5分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，将沉淀重悬于600 µL预冷的分选缓冲液中。

将样品通过5毫升FACS管的网状滤膜盖过滤，并将细胞置于冰上避光保存，以进行立即的细胞分选。通过FACS分离造血内皮细胞时，首先圈选CD45阴性细胞群体；然后在CD45阴性群体中，圈选CD31阳性细胞。

接着在 CD31 阳性细胞群中，圈定 VE-cadherin 阴性细胞群。然后在 VE-cadherin 阴性细胞群中，圈定 c-Kit 阳性细胞。从 c-Kit 阳性细胞群中，圈定 CD34 阳性细胞群。

最后，从 CD34 阳性细胞群中鉴定并收集 KDR 阳性细胞。将生血内皮细胞接种于专为造血祖细胞、红系集落形成单位以及红系爆式集落形成单位设计的甲基纤维素培养基中，于第 8 天计数集落形成单位-粒细胞-巨噬细胞，以及集落形成单位-粒细胞、红细胞、巨噬细胞和巨核细胞。

在第14天计数多能性造血祖细胞集落。每接种1000个生血内皮细胞，大约可形成20个集落形成单位。培养物中也可观察到具有内皮细胞形态的细胞。

这些是能够在单细胞水平上产生多谱系造血祖细胞的生血内皮细胞。该方案是一种二维无血清且无需小鼠饲养层细胞的培养系统，可在大约一周内生成人源生血内皮游戏副本。