CUBIC 协议在全层皮肤样本中以单细胞分辨率可视化蛋白表达

本实验的总体目标是在三维水平上以单细胞分辨率观察细胞增殖和蛋白质表达模式，并精确评估皮肤的解剖结构和病理特征。该方法有助于解答一些关键科学问题，例如细胞与分子机制如何调控表皮发育与再生，以及这些机制在皮肤疾病过程中如何被干扰。该技术的主要优势在于，它是一种技术上简便的实验方案，能够以 unprecedented 的精确度在三维空间中对全层皮肤活检样本中的单个细胞进行可视化观察。

该方法还有助于研究完整皮肤样本中表皮与真皮之间的相互作用。通常，初次接触该方法的研究人员在制备小型扁平皮肤活检样本时可能会遇到一定困难，难以避免损伤毛囊。本次操作演示将由澳大利亚新南威尔士大学发育与再生皮肤科研究组的博士生Betty Maclarios进行。

首先使用修毛器剃除已安乐死小鼠颈部的毛发，注意避免损伤皮肤。然后用70%乙醇和PBS对皮肤进行去污处理。接着用镊子提起背部颈部皮肤，使用剪刀切除一块约1.5 cm × 4 cm的背部皮肤区域。

然后将皮肤真皮面朝下展平在一张滤纸上，注意记录样本的前后方向，并沿解剖好的皮肤边缘修剪滤纸。为获得最佳成像效果，皮肤样本需保持平整，且毛囊方向一致。为确保样本保持正确的前后位置，我们将皮肤组织块以矩形活检方式固定在滤纸上。

将样本转移至含有新配制的4%PFA和PBS的15 mL离心管中。待样本在滤纸上牢固固定后，将标本转移至新的含有PBS的15 mL离心管中，进行两次，每次五分钟的洗涤。在第二次洗涤后，为清除皮肤活检组织，使用锋利的剃须刀片将组织切成约0.2 cm × 0.5 cm的片段，注意样本的长边应沿样本的前后方向切割。

沿毛囊方向平行于皮肤活检样本的一侧进行切割，有助于避免对毛囊造成严重损伤。随后将活检组织置于新标记的15 mL离心管中，加入5 mL新配制的cubic one透明化溶液，于37°C杂交炉内的旋转平台上孵育。待组织块变得透明后，用4 mL PBS在37°C下进行四次洗涤，每次6小时，随后在37°C下用含20%（质量/体积）蔗糖的PBS溶液洗涤4小时。

孵育结束后，将每个样品在最佳切割温度包埋剂中分别放入15 mL离心管内，于–80 °C过夜冷冻，以增强组织对抗体渗透的通透性。次日早晨，用相应的抗体和感兴趣的活体染料对皮肤样品进行染色。然后将标本置于2 mL离心管中，加入1 mL新配制的CUBIC-L2透明化溶液，在37 °C培养箱中振荡孵育24小时，以均衡组织的折射率。

将组织置于适当位置后，沿单个玻璃盖玻片的长边放置活检样本，使毛囊的生长方向与盖玻片表面平行。在组织上滴加一滴 Cubic Two 溶液。在盖玻片上放置两条规格为 1 mL × 2 cm 的蓝色橡皮泥条，然后用第二块盖玻片覆盖活检样本。

接下来将成像腔室置于共聚焦显微镜载物台上，并将组织移入光路中。使用适当的光源和标准的落射荧光滤光片，扫描样品以识别荧光标记的目标区域，然后采集这些目标区域的荧光共聚焦图像。利用该方法，可对成年野生型小鼠的厚背侧皮肤活检组织进行透明化处理，并使用针对基底角质形成细胞标志物角蛋白14（keratin 14）的抗体进行染色。

Dappy 阳性细胞核在整个样本中可见，有助于观察一些解剖学特征，例如真皮乳头。K14 染色出现在表皮间毛囊基底层中，该层仅由单层细胞构成。K14 清晰勾勒出皮脂腺以及毛囊的外根鞘，并在次级毛囊胚中可见，而在毛囊隆突区域仅检测到低水平的 K14 表达。

为了观察增殖细胞，可在成年野生型小鼠毛发休止期（telogen）获取全层背部皮肤活检样本，经透明化和染色处理后显示：在表皮基底层和毛囊峡部存在增殖的角质形成细胞，但在毛囊隆突区则无此现象。为观察皮脂腺，可在成年野生型小鼠毛发生长期（antigen）获取全层背部皮肤活检样本，经透明化和染色处理，有助于检测毛囊峡部区域的皮脂腺。为观察表皮形态变化及转基因动物中的表型，可对全层背部皮肤活检样本进行透明化和染色处理，结果显示表皮间毛囊区域出现增生，毛囊结构异常，K14标记的细胞团块向真皮近端延伸，代表扩增的转基因干细胞群体。

观看本视频后，我们应能充分理解如何制备和澄清皮肤样本，并在三维空间中以单细胞分辨率观察蛋白质表达模式。该方法操作简便，所用试剂相对安全且成本较低。未来将测试更多抗体与本方法的兼容性，从而拓展该分析技术的应用范围，以观察更多蛋白质及特定类型的靶标分子。

其他成像方法（如光片显微镜）可用于三维可视化较大皮肤样本的皮肤解剖结构和蛋白质表达模式。该技术开发完成后，将为皮肤科学领域的研究人员探索真皮与表皮在皮肤稳态、基因修饰小鼠模型以及我们的一种皮肤疾病模型中的细胞与分子相互作用提供新的途径。