快速定量T淋巴细胞有丝分裂原诱导的母细胞化以鉴定免疫调节药物

本实验的总体目标是通过测量T淋巴细胞的母细胞化或母细胞转化，利用自动细胞计数仪评估免疫调节药物的效力。该检测方法利用配备细胞直径测量功能的自动细胞计数仪，快速定量T淋巴细胞的活化程度。该技术的主要优势在于，与常用的T淋巴细胞增殖检测方法不同，它能够对单个细胞进行快速、简便且直接的测量。

使用免疫调节药物处理淋巴细胞会增加或降低细胞发生母细胞化的速率和程度。利用细胞计数法，每个样本大约四分钟即可测定母细胞化的程度。在动物处死后十分钟内，用70%乙醇喷洒小鼠腹部，并用剪刀在动物左侧的毛皮和皮肤上做一切口。

分开并后拉皮肤以暴露腹膜。然后在切口部位涂抹4%氯己定。使用另一套剪刀和镊子，沿腹部中央做2至3厘米的切口，以打开腹膜。

然后，去除脾脏周围附着的内脏组织和多余脂肪，并将组织转移至含有DPBS的容器中。接着，在一个10厘米的培养皿中加入10 mL完全RPMI 1640培养基，用两片灭菌的磨砂玻璃片轻轻碾压脾脏。将细胞悬液通过无菌的40 µm尼龙细胞滤网过滤至一个新的10厘米培养皿中，以去除结缔组织和碎片，然后将单细胞悬液转移至50 mL锥形离心管中进行离心。

将沉淀重悬于20毫升红细胞裂解缓冲液中。室温下轻轻摇动10分钟后，再次离心收集细胞，并将沉淀重悬于10毫升新鲜培养基中。然后再次离心细胞，重悬于2毫升37摄氏度的完全培养基中。

为纯化T细胞，首先用5毫升完全RPMI培养基冲洗每个脾脏对应的一至两个尼龙毛柱两次，并将尼龙毛柱置于37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养孵箱中孵育1小时。孵育结束时，将2毫升分离得到的脾细胞悬液加至每根柱的顶部，让细胞流经柱体，直至液体到达尼龙毛顶部。随后，在柱顶部加入2毫升新鲜的37摄氏度完全培养基，使培养基流经尼龙毛，直至柱顶部的液体再次达到尼龙毛顶端。

现在用3毫升37摄氏度的完全培养基覆盖羊毛，并将柱子放回细胞培养孵育箱中，使B细胞、成纤维细胞和辅助细胞全部贴附到羊毛纤维上。一小时后，在新的50毫升锥形管中，用5毫升新鲜完全培养基洗涤柱子两次，以洗脱未贴壁的T细胞。然后通过离心收集细胞。

用十毫升完全培养基洗涤T细胞一次后，将细胞沉淀重悬于两毫升新鲜完全培养基中。随后对细胞进行计数，并用新鲜完全培养基将细胞悬液稀释至每毫升0.5×10⁶个细胞的浓度，根据实验需要接种至六孔或二十四孔细胞培养板中。在分离后24小时内，使用适当的刺激物及感兴趣的实验药物激活经尼龙毛柱分离的T细胞。

在12至72小时后，使用1毫升移液器轻轻混匀经激活处理的细胞，以去除任何团块。为通过自动细胞计数仪测量细胞直径，将每个孔中1毫升处理后的细胞转移至各自的样品杯中，并将样品杯放入自动细胞计数仪的样品转盘内。输入样品编号和细胞类型信息以记录样品，并开始运行样品检测。

将台盼蓝与细胞悬液混合后，使细胞流过成像区域，直至每个样本收集到约100个细胞图像。软件会在每个检测到的台盼蓝染色和未染色细胞周围绘制圆形，以确定细胞直径。当所有细胞测量完成后，数据将导出至电子表格，显示每个测量直径对应的总细胞数和活细胞数结果。

随后可将数据以直方图形式呈现。在使用佛波酯（PMA）和离子霉素刺激两天后，可观察到频率分布的中位数显著向更大细胞直径方向偏移，同时小直径T细胞的数量相应减少。在固定250纳米浓度离子霉素的条件下，将激活刺激物PMA的浓度从每毫升2纳克提高至250纳克时，其效应无明显变化。

T细胞增殖方面也未观察到明显差异。钙调神经磷酸酶抑制剂类药物可部分抑制T细胞母细胞化和增殖。使用靶向活化T细胞中钙调神经磷酸酶核因子的免疫抑制化合物处理T细胞，可使母细胞化反应抑制近72%。

雷帕霉素和FTY720对淋巴细胞母细胞化具有中等但统计学上显著的影响。而TRAM34即使在700纳摩尔浓度下也显然不影响小鼠T细胞的增殖。当雷帕霉素与环孢素A联合使用时，淋巴细胞母细胞化被完全抑制。

使用抗CD3和抗CD28偶联的磁珠激活的小鼠T细胞也观察到类似结果。该检测方法可成功定量评估多种免疫调节药物的作用，相较于传统的增殖检测（其结果还包含凋亡和坏死细胞的贡献），能更准确地评估药物效力。通过该方法，可对多达15个样本进行连续测量，从而同时并连续地定量分析母细胞化和增殖速率。

偶尔会有气泡进入流动池，导致测量结果无法使用，因此在每次试验的数据被接受用于分析之前，应检查所有图像中是否存在气泡。该方法的一个局限性在于，如果样品中杂质过多，测量可能会将杂质误判为活细胞。经过适当的改进，该检测方法有望被用于研究中性粒细胞和肝细胞的细胞大小变化。