使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯定量增殖的人抗原特异性CD4⁺ T细胞

本方案提供了一个研究CD4T细胞反应的平台，这类反应通常较弱且难以检测。该技术能够在无需预先了解抗原呈递情况的条件下，实现对CD4T细胞的检测、计数和分离。其主要优势在于能够分析那些通常极为稀少、且与1型糖尿病等自身免疫性疾病相关的CD4T细胞群体。

从健康供体获取外周血样本后，先用 PBS 至少按 1:2 的比例稀释血液，然后将 35 毫升血液小心叠加至装有 15 毫升密度梯度介质的 50 毫升离心管中。通过密度梯度离心法分离细胞，并移除约 20 毫升上层血浆。随后收集白细胞层，注意避免接触红细胞沉淀，再用新鲜 PBS 洗涤细胞三次。

计数后，将细胞稀释至每毫升 PBS 中含 1 × 10⁶ 个外周血单个核细胞（PBMC）。每个对照组分别向 10 毫升离心管中加入 300 微升细胞悬液。用 PBS 补充各管体积后，通过离心沉淀细胞，并将细胞重悬于 RP5 培养基中，调整浓度为每毫升含 1 × 10⁶ 个细胞。

然后，将每种对照细胞各100微升接种到96孔板的三个孔中，每孔预先加入100微升RP5培养基。将该培养板置于细胞培养箱中培养七天。接着，将剩余的PBMC转移至一个新的50毫升离心管中，并沿管壁向每1毫升细胞悬液加入1微升CFSE工作液。

迅速倒置试管数次以混匀，并将细胞置于细胞培养箱中孵育5分钟。孵育结束后，加入5 mL RP5培养基终止反应，并通过离心收集细胞。将沉淀重悬于新鲜RP5培养基中，浓度为每毫升含1 × 10⁶个PBMCs，并将1 mL细胞悬液分别加入每支含待测抗原的10 mL试管中。

然后，将细胞以每种抗原100微升的量加入至96孔板中的三个孔，每孔预先含有100微升RP5培养基，并分别补充相应稀释的目标抗原。将该培养板置于细胞培养箱中培养七天。为进行流式细胞术分析而对CD4+ T细胞群体染色时，在培养结束时，将每个孔中的全部细胞转移至各自的荧光激活细胞分选（FACS）管中。

用1毫升含0.1%胎牛血清（FCS）的PBS洗涤每个样品。将沉淀重悬于适量抗人CD4抗体中，每管加入100微升含FCS的PBS。将细胞在4°C避光孵育20分钟。

孵育结束后，每管加入一毫升新鲜 PBS 加 FCS 洗涤样品，并将沉淀重悬于 100 微升新鲜 PBS 加 FCS 中。分析前立即向每管加入一微升碘化丙啶，以排除死细胞。根据淋巴细胞的前向散射和侧向散射区域设门。

为了排除凋亡细胞，根据前向散射面积对碘化丙啶阴性细胞设门，并使用未染色细胞设定非荧光细胞的电压基线。调整CD4抗体荧光染料和CFSE信号的电压，使每种荧光信号均低于1000。利用单色对照CFSE和CD4样本，结合未染色细胞设定的电压，确认每种颜色均出现阳性荧光信号。

由于CFSE和碘化丙啶存在一定的光谱重叠，需调整补偿以从CFSE荧光中扣除碘化丙啶的荧光信号，直至仅含CFSE的样本在碘化丙啶检测通道中无信号输出。当所有样本分析完成后，通过将抗原刺激组中每5000个未分裂细胞对应的分裂细胞数除以无抗原培养组中每5000个未分裂细胞对应的平均分裂细胞数，计算细胞分裂指数。几乎所有供体在体外刺激后均表现出对破伤风类毒素强烈的T细胞反应，因为这些供体均接种过疫苗，从而使破伤风类毒素成为一种有效的阳性对照抗原。

然而，未受刺激的外周血单个核细胞（PBMC）中CD4+T细胞的增殖极为有限。在使用人胰岛素原C肽刺激七天后，可在1型糖尿病患者外周血中检测到针对胰岛素原C肽的特异性CD4+T细胞。用甲型流感病毒基质蛋白刺激的PBMC也表现出增殖现象。

综上所述，这些数据表明，该检测既可使用全长蛋白，也可使用短的合成肽段进行。该方法的流式细胞术部分可利用细胞分选流式细胞仪完成。通过细胞分选仪，可将抗原特异性T细胞在单细胞水平上分离，用于后续分析。

该方法已实现了在早发性1型糖尿病患者中发现CD4T细胞反应。利用其他方法分析这些罕见的T细胞群体则面临多种技术挑战。