评估 c-Fos 和 Dusp1 在癌基因依赖性中作用的方法

该方法有助于解答癌症治疗领域中的关键问题，例如鉴定参与癌基因依赖性的关键基因。该技术的主要优势在于利用了多种激酶驱动型癌症中普遍存在的癌基因依赖性，因此可适用于多种肿瘤类型。尽管该方法可为白血病研究提供见解，但也同样适用于其他系统，如肺癌、脑瘤和胰腺癌等实体瘤。

通常，由于缺乏分子生物学和细胞生理学方面的经验，初次接触该方法的研究人员会遇到困难。首先，从安乐死的小鼠中取出腿骨。用手术刀清除骨骼上的组织。

然后将骨骼置于冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，并用研杵研碎骨骼。接着，使用10毫升移液管将细胞悬液通过70微米细胞滤网过滤至50毫升螺口离心管中。用预冷的PBS多次冲洗研钵和研杵，并将冲洗后的细胞悬液一并加入50毫升离心管中。

接下来离心骨髓并用真空泵和玻璃移液管吸除上清液。用5毫升PBS重悬细胞沉淀。使用移液器将悬浮的骨髓缓慢加至室温的聚蔗糖溶液顶部。

此后，将聚蔗糖在400 ×g 条件下离心20分钟，离心时关闭刹车。离心结束后，用移液器收集浑浊的总单个核细胞界面，并转移至一个新的15毫升离心管中。用PBS将体积调至10毫升，并取出20 µL用于细胞计数。

离心后，弃去上清液，将沉淀置于冰上。接着，用含EDTA和BSA的PBS重悬细胞沉淀。向细胞悬液中加入CD117磁珠，涡旋混匀。

此后，在 4 摄氏度下将悬液孵育 10 分钟。然后用含 EDTA 和 BSA 的 PBS 将体积补至 10 毫升，在 4 摄氏度下以 1200 ×g 离心 5 分钟。用真空泵吸去上清液，并将细胞沉淀重悬于含 EDTA 和 BSA 的 PBS 中。

然后将3毫升含EDTA和BSA的PBS加入置于磁力架上的磁性柱中，并使其流入收集管。待缓冲液完全流过柱子后，加入细胞悬液，并使其流过柱子进入收集管。接着向柱中再加入5毫升含EDTA和BSA的PBS，并立即用推杆冲洗柱子。

取出活塞，并在计数细胞前重复冲洗。离心细胞后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于完全IMDM培养基中进行培养。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养过夜。

首先，将逆转录病毒质粒DNA、包装质粒、氯化钙和水在1.5毫升离心管中混合。然后，在另一支1.5毫升离心管中加入500微升HBS。在涡旋振荡器调至最低转速持续混匀的同时，将转染混合物逐滴加入含有HBS的离心管中。

将转染混合物在室温下孵育20至30分钟。在孵育期间，向HEK细胞中加入氯喹，并将细胞置于培养箱中。加入转染混合物后，将细胞在37摄氏度、5%CO2的培养箱中孵育8小时，并通过非常缓慢地加入14毫升新鲜DMEM10培养基更换细胞培养液。

沿培养皿壁缓慢移液有助于防止HEK细胞脱落。随后将细胞在37摄氏度、5% CO2的培养箱中孵育过夜。使用10毫升注射器收集病毒上清液。

然后将一个0.45微米的注射器滤器连接到注射器上。将病毒上清液推入一个新的收集管中。约16小时后收集病毒上清液。

此后，向未经处理的6孔培养板中加入2毫升PBS中的重组人纤连蛋白片段。次日，使用移液器从培养板中移除纤连蛋白。用含2% BSA的PBS封闭培养板，并在室温下孵育30分钟。

使用真空泵吸除 BSA，并用 PBS 洗涤孔板，然后再次使用真空泵吸去 PBS。随后立即加入过滤后的病毒上清液，并将孔板离心两小时。用真空泵吸去上清液后，再次离心孔板。

接下来用真空泵吸去上清液，并用 PBS 洗涤病毒包被的孔板。再次用真空泵吸去 PBS，向病毒包被的孔板中加入先前培养的 c-Kip 阳性小鼠细胞。离心后，将细胞置于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育。

转导后48小时，通过离心收集细胞，并将其重悬于FACS缓冲液1中。首先将含细胞因子的甲基纤维素在室温下解冻，然后在FACS管中分装3毫升甲基纤维素。

向3毫升甲基纤维素中加入100微升含有适当抑制剂的细胞悬液。然后以高速涡旋振荡悬液10至30秒。待大部分气泡逸出后，用1毫升注射器将1毫升培养基接种至三个重复培养皿中。

将培养皿放入一个大的培养皿中，并放入一个含有无菌水的敞口培养皿。然后盖上大培养皿，在37°C条件下培养细胞。通过将10毫克碘硝基四唑氯化物溶解于10毫升水中，制备碘硝基四唑氯化物染色液。

使用带有0.2微米滤器的鲁尔锁式注射器对染色液进行过滤除菌。在组织培养超净台内，将100微升染色液逐滴加入CFU平板周围。然后将平板置于细胞培养孵育箱中，在37摄氏度下孵育过夜。

最后，待菌落变为深红棕色后，在无菌细胞培养操作台中使用白色背景对染色的CFU平板进行拍照。在本方案中，采用了多种无偏倚的基因表达分析方法，以鉴定协调癌基因成瘾性的遗传组分。为了验证c-Fos和Dusp1作为白血病治疗靶点的作用，通过表达BCR-ABL1癌基因的细胞确认了它们的过表达。

通过RT-qPCR和蛋白质印迹分析证实，c-Fos和Dusp1均受BCR-ABL1诱导，且其表达可被生长因子IL-3增强。通过FACS分选YFP阳性表达细胞，用于后续的体外和体内实验。结果表明，单独敲除c-Fos或Dusp1均可抑制集落形成单位（CFU）数量。

缺乏 c-Fos 和 Dusp1 的细胞在形成集落的能力上显著受损，而伊马替尼处理则清除了所有的集落形成单位（CFUs），表明 c-Fos 和 Dusp1 的缺失与 BCR-ABL1 表达之间存在合成致死关系。在此进展之后，该技术为癌症领域的研究人员探索驱动癌基因依赖性的遗传网络和基因，以及这些基因如何影响小鼠模型和人类患者的特定反应铺平了道路。请务必注意，操作逆转录病毒和患者样本可能具有极高危险性，在执行该实验流程时应严格遵守实验室安全规范。