利用邻位连接实验在 C. elegans 生殖系中检测核糖核蛋白复合物的原位组装
2020年5月5日
本方案演示了使用邻近连接技术检测蛋白质-蛋白质相互作用 原位 在 秀丽隐杆线虫 生殖系
邻近连接实验可使研究人员在原位检测蛋白质-蛋白质相互作用，揭示这些相互作用的空间和时间分布模式。该技术有助于解答有关秀丽隐杆线虫发育调控的重要科学问题。与其他技术（如FRET和BiFC）相比，该方法在检测蛋白质-蛋白质相互作用时具有相当的灵敏度，且操作更为简便。
从未解剖过线虫以释放性腺的个体可能在该步骤中遇到困难。建议先练习解剖线虫，并将其用于免疫荧光实验，以熟练掌握操作和解剖技术，再进行邻近连接实验（PLA）。开始时，挑选30至40条年轻成虫线虫，放入含有500 µL 1× M9缓冲液和左旋咪唑的表面皿中。
收集线虫后，小心移除并弃去大部分培养基，以去除随线虫转移的细菌。加入新鲜的 500 µL 1× M9 缓冲液以及左旋咪唑，用移液器轻轻吸打液体以清洗线虫。随后小心移除并弃去大部分液体。
重复洗涤两到三次。洗涤结束后，将线虫置于约100微升培养基中，时间不超过八分钟。使用玻璃或聚乙烯移液管，将线虫转移至经001%多聚赖氨酸包被的25毫米×75毫米显微镜载玻片上。
吸除多余培养基，使载玻片上残留约15微升。去除过量缓冲液对于确保解剖后的线虫及性腺能够黏附于载玻片至关重要。在解剖显微镜下，使用两根26½号细针，将一根针置于另一根之上，使针尖端形成剪刀状结构。
以这种方式放置针头，从咽部后方切割线虫，以释放生殖腺。在五分钟内解剖完所有线虫。所有线虫解剖完毕后，轻轻将一块22毫米×40毫米的盖玻片置于载玻片上，使其与载玻片垂直。
盖玻片的两端应悬于载玻片之外。将载玻片置于预先冷却的铝块上，并在干冰中冷冻至少20分钟。轻轻将一支预冷的铅笔置于盖玻片上方，以防止盖玻片因冰膨胀而松动。
准备固定时，用铅笔轻弹盖玻片使其脱落，立即将载玻片浸入盛有新鲜冰甲醇的容器中，固定1分钟。随后轻轻擦拭载玻片上样品周围区域的边缘，并在室温下加入150 µL甲醛固定液，固定5分钟。将载玻片以垂直90度角接触纸巾，使固定液从载玻片上流出并被纸巾吸收。
在室温下，用含有50毫升PBT/BSA的考普林瓶将载玻片封闭两次，每次15分钟。然后用含有10%正常山羊血清的PBT/BSA溶液封闭载玻片。轻轻擦拭载玻片周围边缘，并在每张载玻片上加入100微升该溶液。
轻轻晃动载玻片以帮助溶液均匀铺展。在湿润孵育盒中室温孵育1小时。将载玻片置于纸巾上，使溶液自然流下，并轻轻擦拭边缘。
为了封闭载玻片，在14毫米×14毫米的区域内加入一滴封闭剂。将载玻片置于湿盒中，于37摄氏度孵育1小时。将载玻片放在纸巾上，使封闭剂从载玻片上流下，并轻轻擦拭边缘。
使用抗体稀释液稀释一抗。每张载玻片上 14 毫米 × 14 毫米的区域加入 40 微升稀释后的一抗溶液。将载玻片置于湿盒中，在 4 摄氏度下孵育过夜。
早上，将载玻片在 Coplin 染色缸中用 50 毫升 1× 洗涤缓冲液 A 于室温下洗涤两次，每次五分钟。将 Coplin 染色缸置于设定为 60 rpm 的旋转摇床上。将载玻片放在纸巾上，使洗涤缓冲液从载玻片上流下，并轻轻擦拭边缘。
配制40微升含有正负探针的溶液。将该溶液加入每个14×14毫米的区域中。将载片置于湿盒中，在37摄氏度下孵育1小时。
在室温下，将载玻片置于Coplin瓶中，用50毫升1×洗涤缓冲液A洗涤两次，每次5分钟。将Coplin瓶置于设定为60 rpm的旋转摇床上。用超纯水将连接缓冲液按1:5比例稀释。
使用此缓冲液将连接酶按1:40稀释，以制备连接反应工作液。将玻片置于纸巾上，使洗涤缓冲液从边缘流下，并轻轻擦拭边缘。向每个14毫米×14毫米的区域加入40微升连接反应液。
将载玻片置于湿盒中，37摄氏度孵育30分钟。按照前述方法洗涤并干燥载玻片后，向每个14 mm × 14 mm的区域加入40 µL新配制的扩增溶液，避光保存。将载玻片置于湿润、避光的孵育盒中，37摄氏度孵育1小时40分钟。
用50毫升1×洗涤缓冲液B将载玻片洗涤两次，每次10分钟，再用50毫升0.1×洗涤缓冲液B洗涤一次，每次1分钟。待载玻片环氧涂层边缘干燥后，向每个样本加入10微升封片剂，轻轻盖上盖玻片，使封片剂均匀铺展。用指甲油沿盖玻片边缘涂抹，以密封盖玻片和载玻片。避免移动盖玻片。
将指甲油在室温下避光静置至少20分钟，使其充分硬化。利用FLAG和GFP抗体对生殖腺进行共免疫染色，揭示了它们在生殖腺中的表达模式。GFP在整个生殖腺中均有表达，而OMA-1:GFP的表达则局限于晚期粗线期和卵母细胞。
FLAG免疫染色显示，3xFLAG:DLC-1在两种品系的整个生殖系中均有表达。生殖系中用于PLA定量分析的目标区域包括晚期粗线期至所有卵母细胞的区域，该区域也是OMA-1的表达区域。
与3xFLAG:DLC-1、GFP生殖系相比，3xFLAG:DLC-1、OMA-1:GFP生殖系在该区域内似乎具有更多的PLA信号点。确保腔室内有足量的水以提高湿度。同时，确保载玻片在腔室内保持水平，以防止试剂流失。
经过邻近连接实验后，可使用共聚焦显微镜对挤出的性腺进行成像，并利用 Fiji 和 ImageJ 工作流程进行定量分析。该定量分析有助于判断相互作用是否具有统计学显著性。PLA 技术使我们能够在原位评估线虫生殖系发育关键调控因子之间的相互作用。
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概述
本方案展示了利用邻近连接技术在秀丽隐杆线虫（C. elegans）生殖系中就地检测蛋白质-蛋白质相互作用。该技术能够检测这些相互作用的空间和时间模式，为理解秀丽隐杆线虫发育调控机制提供重要信息。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 发育生物学
背景
- 邻近连接实验（PLA）是一种用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法。
- 该方法的灵敏度与其他技术（如FRET和BiFC）相当。
- 理解蛋白质相互作用对于研究发育过程至关重要。
- 进行该实验需要具备解剖技能，以处理秀丽隐杆线虫（C. elegans）。
研究目的
- 研究秀丽隐杆线虫（C. elegans）生殖系中的蛋白质-蛋白质相互作用。
- 揭示这些相互作用的空间和时间动态特征。
- 提供一种比复杂相互作用检测方法更简便的替代方案。
使用的方法
- 用于检测相互作用的邻近连接实验。
- 解剖秀丽隐杆线虫以获取性腺。
- 用于可视化的免疫荧光技术。
- 使用年轻成虫期线虫以获得最佳结果。
主要结果
- 成功实现了原位蛋白质-蛋白质相互作用的检测。
- 揭示了秀丽隐杆线虫（C. elegans）发育调控的重要机制。
- 证明了与其它方法相比，邻近连接技术（PLA）的有效性。
- 为初次进行线虫解剖的研究人员提供了实用的操作指南。
结论
- PLA 是研究秀丽隐杆线虫（C. elegans）中蛋白质相互作用的有力工具。
- 该方法在不牺牲灵敏度的前提下，简化了相互作用的检测流程。
- 熟练掌握解剖技术对于成功应用该方法至关重要。
常见问题
行业重要性概要
邻近连接实验（PLA）能够在原位以空间和时间分辨率检测蛋白质-蛋白质相互作用，有助于在与疾病相关的系统中进行靶点验证。该方法通过阐明生殖系发育模型中的相互作用动态，为早期发现提供机制层面的风险降低依据，增强预测可信度。该技术为检测开发流程提供了可扩展、可重复的替代方案，相较于FRET或BiFC等复杂技术更具优势。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过绘制干细胞和减数分裂调控中的蛋白质相互作用网络，实现对治疗假设的探究。
- 操作价值：通过在完整组织中直接可视化相互作用位点，支持功能靶点的验证。
- 预测价值：提供定量且具有空间分辨的相互作用数据，用于项目筛选，减少机制上的不确定性。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成标准化的定量读数，适用于针对蛋白质相互作用界面的调节剂进行高内涵筛选。
- 操作价值：建立可在不同模型系统间重复使用的相互作用检测流程，且所需专用设备极少。
- 可扩展性：由于与标准免疫荧光基础设施兼容，便于在后续验证实验中重复使用该平台。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过保守的种系调控通路，将发现阶段的相互作用图谱与临床前模型相连接。
- 生物标志物匹配：能够在与疾病相关的背景下，将相互作用模式与表型结果进行关联分析。
- 基于风险的推进决策：通过在生理相关系统中验证靶点结合，为继续或终止决策提供依据。
流程与工作流整合
PLA 适用于从靶点假设验证到先导化合物鉴定的整个发现过程，所提供的相互作用数据可连接表型筛选与机制性后续研究。
- 发现生物学：通过揭示关键调控复合物的组装时机与位置，支持通路解析和生物学风险降低。
- 筛选：提供可用于评估化合物对蛋白质相互作用网络影响的即用型定量检测结果。
- 分析：利用标准化的图像定量工作流程，实现不同条件下相互作用频率的统计学比较。
- 转化研究：通过在已验证模型中将相互作用动态与发育表型关联，推动临床前研究的连续性。
- 企业级复用：作为模块化能力，支持在多个靶点和项目中进行相互作用验证。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接的原位相互作用证据，提高对靶点机制的预测可信度。
- 操作价值：通过明确定义的固定、探针杂交和扩增步骤，增强跨实验室的可重复性和标准化水平。
- 战略价值：减少对复杂且通量较低的相互作用检测方法的依赖，提高资本使用效率。
- 项目组合影响：基于在疾病相关组织中验证的相互作用谱，实现对靶点的风险校准优先排序。
实施注意事项
- 需要具备组织制备和免疫荧光技术方面的专业知识，以获得最佳的信噪比。
- 依赖共聚焦显微镜及图像分析工具（如 Fiji/ImageJ）进行定量分析。
- 需对模型系统中特定蛋白质靶标的抗体进行验证和优化。
- 需要标准化封闭、探针孵育和孵育条件，以尽量减少背景信号。
- 在某些样本类型中，受限于组织的可获取性以及固定方法的兼容性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Dissection/Gonad Extrusion
2:46
Fixation/Blocking
4:14
Primary Antibody Incubation and PLA Probe (Secondary Antibody) Incubation
5:21
Ligation
6:09
Amplification and Final Washes
6:45
Coverslip Mounting
7:15
Results: Germlines Following Co-immunostaining or PLA
8:10
Conclusion
