用于组织工程与疾病研究的儿童人食管上皮细胞的条件性重编程

本实验的总体目标是从内镜活检获取的患者来源食管上皮细胞进行扩增，以研究食管疾病，或构建三维食管支架用于后续建模或食管组织替代。该方法可用于深入理解食管上皮细胞在食管疾病中的作用，也可用于构建三维支架以进行疾病建模或植入应用。

该技术的优势在于，无需进行任何基因或永久性修饰，即可利用极小的组织样本生成患者特异性的上皮细胞。该技术的应用前景包括深入理解嗜酸性粒细胞性食管炎的发病机制，以及开发针对食管闭锁和嗜酸性粒细胞性食管炎的治疗方法。通常，初次使用该技术的研究人员在收获人食管上皮细胞之前，往往难以彻底去除饲养层细胞，从而影响细胞纯度。

本技术由本实验室的技术员 Christopher Foster 演示。在获取患者样本前至少三天，将3T3细胞接种于组织培养处理过的T75培养瓶中，使用3T3培养基进行培养。实验当天，在获取样本前，每瓶加入5毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA，在37°C下作用约五分钟，使3T3细胞脱落。

当大部分细胞处于悬浮状态时，加入5毫升3T3培养基以终止反应，并将细胞悬液转移至15毫升锥形管中进行离心。用培养基重悬沉淀后进行细胞计数。然后，将适量细胞转移至15毫升锥形管中用于接种。

接下来，向细胞中加入 25 毫升新鲜的 3T3 培养基，用于 3000 rads 的照射。然后通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于条件重编程培养基中，每 100 毫米培养皿加入 5 毫升。在内镜检查时获取约六块食管活检组织后，将六块活检组织置于含有完全无血清角质形成细胞培养基的 15 毫升锥形管中，培养基中添加 Primocin，并将锥形管置于湿冰上。

将一份活检组织置于含有五毫升缓冲福尔马林的湿冰中，另一份活检组织放入含有包埋介质的小型活检冷冻模具中。立即将模具浸入盛有冰或戊烷的烧杯中，再将烧杯置于液氮容器内。待组织完全冻结后，将冷冻模具放入装有干冰的聚苯乙烯泡沫容器中的标本袋内。

然后，将活检样本管放入带有生物危害标签的密封袋中，并置于装有湿冰的运输箱内，用生物危害警示贴密封并标记两个容器，运送到实验室。进入实验室后，立即将冷冻的活检样本转移至零下80摄氏度环境中储存，用于后续切片或RNA提取。将样本置于福尔马林中，在4摄氏度冰箱中过夜固定，并将剩余的活检样本放入离心机中。

将每根试管中的培养基更换为10毫升dispase溶液，密封试管后于37°C水浴中孵育15分钟。孵育结束后，再次离心沉淀组织样本，并将样本重悬于5毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液中。将组织样本转移至一个100毫升无菌培养皿中，使用两把灭菌的剃刀尽可能将组织切碎。

当所有组织切割完毕后，将组织碎片转移至一个新的15毫升离心管中，并用5毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液冲洗培养皿两次。将洗涤液合并至该离心管中，然后将样品重新置于37°C水浴中。10分钟后，离心消化后的组织片段和饲养细胞，分别将沉淀重悬于5毫升条件重编程培养基中。

然后，将饲养层细胞和食管活检样本合并至同一管中，并加入Rho激酶（ROCK）抑制剂，将细胞接种于明胶包被的组织培养皿中进行共培养。约五天后，通过抽吸去除培养基和组织碎块，并用5毫升无菌PBS冲洗培养皿两到三次。最后一次洗涤后，向培养板中加入10毫升含有ROCK抑制剂的新鲜培养基，将共培养物放回培养箱中继续培养，直至细胞达到70%融合度。

为扩增细胞，使用5毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA在37摄氏度条件下消化，时间不超过2.5分钟，以去除饲养层细胞。用5毫升新鲜PBS冲洗培养板，以去除悬浮的饲养层细胞，然后加入5毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA，孵育5至10分钟，直至活检样本细胞从培养板底部松脱。接着，加入10毫升新鲜培养基终止反应，并将细胞转移至50毫升锥形管中进行离心。

将沉淀重悬于新鲜的条件重编程培养基中进行计数，取1×10⁶个人源食管细胞加入到一个新的锥形管中。向食管细胞中加入1.2×10⁶个经辐照的3T3细胞，并用新鲜的条件重编程培养基将管内总体积补至15 mL。然后向细胞中加入新鲜的ROCK抑制剂，将共培养细胞接种至经明胶包被的150 mm培养皿中。

为将食管细胞冷冻保存于负80摄氏度环境中，需先去除饲养层细胞，并按前述方法消化脱离食管细胞。接着，将细胞转移至新的50毫升锥形离心管中进行离心，然后以每2毫升冷冻保存液重悬1×10⁶个细胞的浓度重新悬浮细胞沉淀。随后，将2毫升细胞悬液分装至各预先标记好的冻存管中，于负80摄氏度保存至少24小时，之后再转移至液氮中进行长期保存。

上皮细胞集落大约在四到五天内形成，并由成纤维细胞饲养层细胞包围。随着这些集落的扩展，它们将与其他集落融合，形成更大的集落。当培养物达到70%融合度时，需要进行扩增。

去除饲养细胞后，可将贴壁的上皮细胞进行胰蛋白酶消化，并重新接种至新的经辐照处理的饲养细胞上。通过qRT-PCR对这些细胞进行表型表征显示，与初始活检样本相比，在第一代末期，祖细胞标志物P63表达上调，表明细胞已被重编程为更接近祖细胞样的干细胞状态。当这些细胞被转移至常规组织培养皿时，P63表达下降，而紧密连接蛋白1（TJP1）和E-钙黏蛋白的表达上升，表明细胞表型由祖细胞向更分化的上皮细胞转变。

传代一次后对细胞进行流式细胞术分析表明，超过90%的细胞也呈EpCAM阳性。免疫荧光染色显示，这些细胞保留了上皮细胞标志物、前体细胞标志物、增殖标志物以及上皮紧密连接蛋白的表达。来自非疾病患者的食管细胞倍增时间计算约为36至40小时，尽管病变细胞的倍增时间可能会更慢。

掌握该技术后，整个操作应在大约一小时内完成。在进行该操作时，务必使用无菌技术以防止污染，并确保快速操作以维持细胞活性。完成该操作后，可进行其他检测，例如transwell培养，以评估引起食管炎症或发病机制的抗原。

该检测方法开发完成后，将有助于研究人员识别引发嗜酸性食管炎的触发性抗原，并为治疗此类患者提供新的治疗选择。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从内镜活检组织中分离和扩增食管上皮细胞，以用于食管疾病的研究或构建三维模型。请务必注意，使用锐器和生物组织可能存在安全风险。

务必妥善处理锐器，并遵循良好的生物安全规范。