构建定义明确的人源工程化心肌组织以研究心肌细胞治疗机制

本实验的总体目标是构建具有明确细胞组成的工程化人源心脏组织。该方法可解决心脏组织工程领域中的若干关键挑战，包括控制细胞变异性和心肌分化效率，以及阐明特定细胞类型对心脏收缩功能的影响。该技术的主要优势在于，最终获得的是细胞组成可控且明确的工程化人源心脏组织。

该技术的重复应用可拓展至心脏病治疗领域，因为明确定义的组织能够提供一种新颖的、具有生物学相关性的生物医学筛选平台，可用于评估治疗干预措施。尽管该方法可为新型心脏治疗药物的研究提供见解，但人源工程化心脏组织系统也可用于理解心脏细胞治疗的机制。从人胚胎干细胞来源的心肌细胞培养物开始，用PBS洗涤细胞一次，并加入一毫升0.04%胰蛋白酶-EDTA。

将细胞在 37 摄氏度、5%CO2 条件下孵育 10 分钟。孵育细胞的同时，向 6 毫升胰蛋白酶中和溶液中加入 12 微升 ROCK 抑制剂。从培养箱中取出培养板，向六孔板的每孔中加入 1 毫升中和溶液。

将每个孔中的所有细胞转移至一个15毫升离心管中。用3毫升PBS洗涤全部六个孔，并将洗涤液与细胞悬液合并至同一离心管中。在4摄氏度条件下，以300 × g离心5分钟，使细胞沉淀。

为进行FACS活细胞分选，需先制备染色缓冲液：将5毫升FBS和50微升ROCK抑制剂加入45毫升预冷的PBS中，置于冰上。弃去离心后细胞沉淀的上清液，加入1.2毫升染色缓冲液重悬细胞。将200微升重悬细胞转移至冰上预冷的新50毫升离心管中。

接着，将剩余的一毫升细胞悬液转移至冰上预冷的新50毫升离心管中，并加入两微升SIRP alpha-PE/Cy7抗体和四微升CD90-FITC抗体。用移液管轻轻混匀细胞悬液，并将离心管置于冰上。将含有阴性对照和样品的两个50毫升离心管置于冰上、4°C条件下，在摇床上孵育一小时。

细胞孵育的同时，将3毫升分化培养基二分别转移至两支15毫升离心管中。然后每管加入3微升ROCK抑制剂，并将这些FACS收集管置于冰上预冷备用。接下来，在4摄氏度下以300 × g离心5分钟，沉淀染色后的细胞。

用 10 毫升预冷的 PBS 洗涤两次。用 1 至 3 毫升含 DAPI 的染色缓冲液轻轻重悬样品沉淀。向阴性对照沉淀中加入 500 微升不含 DAPI 的染色缓冲液。

将两种细胞悬液均通过40微米细胞滤网过滤，以去除细胞团块，然后将其转移至冰上的聚苯乙烯FACS管中。立即送至流式细胞分选仪进行分选。首先从阴性染色对照样本开始，设定门控参数。

然后，在运行样本细胞时，选择DAPI阴性的活细胞群体。在20 PSI条件下，分别收集FITC阳性和PE/Cy7阳性的细胞群体。按照文本方案中所述进行细胞培养和重新聚集后，从培养箱中取出细胞培养板，并将培养基转移至50毫升离心管中。

用 3 毫升 PBS 清洗培养板，并将洗液转移至同一支 50 毫升离心管中。然后向培养板中加入 3 毫升 0.04% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 摄氏度、5% CO2 条件下孵育。5 分钟后，使用显微镜观察细胞是否已脱落。

待所有细胞脱落后，向培养板中加入 3 毫升胰蛋白酶中和液。轻轻混匀后将细胞转移至原先的 50 毫升离心管中。用 5 毫升 PBS 清洗培养板，并将此洗涤液一并加入离心管中。

在室温下以300 × g离心5分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，并将沉淀重悬于1毫升新生牛血清（NBS）培养基中。接着，将细胞转移至1.5毫升微量离心管中。

在室温下以300 × g离心5分钟收集细胞，然后弃去上清液。为开始制备六份经基因工程改造的心脏组织，将60.0 µL浓度为5 mg/mL的胶原蛋白储备液用1.5 µL 1 M氢氧化钠、9.6 µL 10× PBS和24.9 µL无菌超纯水稀释至终浓度为3.125 mg/mL。此步骤中需特别注意避免将气泡引入胶原蛋白混合液中，因为气泡在黏稠溶液中难以释放，可能在组织收缩过程中干扰组织的形成。

用移液器沿15毫升离心管管壁加入12.0微升10X MEM和12.0微升pH为9的0.2正常堆（normal heaps），以稀释胶原蛋白混合物。然后将基底膜基质加入胶原蛋白混合物中，使其终浓度为0.9毫克/毫升，并轻轻混匀。将最终的组织混合物置于冰上保存。

接下来，将整个组织混合物转移至细胞沉淀中，并根据文本方案添加补充细胞。用无细胞的NBS培养基将离心管补至终体积150 µL，并轻轻混匀。小心地将25 µL细胞悬液分别加入生物反应器底板的六个孔中。

在每个孔之间重复混合操作，以重悬可能已沉降的细胞。每次仅向一个孔中加入一种组织，以确保每种组织的体积和细胞数量一致。另外，将两排聚二甲基硅氧烷（PDMS）力传感器分别推入聚砜框架的两侧，形成六对相对的支柱。

将支架倒置在底板上，使一对支柱插入含有细胞悬液的每个孔中。然后将生物反应器放入一个60毫米的培养皿中，并将该培养皿（不加盖）放入一个10厘米的培养皿内。盖上10厘米培养皿的盖子，将整个生物反应器组件移入组织培养孵育箱中。

孵育2小时后，取出生物反应器组件，加入14毫升NBS培养基以覆盖底板。将生物反应器放回细胞培养孵育箱，并每天更换一半培养基。48小时后，每次轻轻移除底板数毫米。

然后将生物反应器翻转，使组织朝下放回培养基中。如果在移除底板时组织从支柱上脱落，应轻柔地将组织重新固定到支柱上。人类胚胎干细胞的分化会形成主要由心肌细胞和成纤维细胞组成的混合培养物，这些细胞会自我组装成簇，并在整个培养皿中形成有力搏动的网状结构。

对这些培养物进行FACS分选结果显示，该分化方法获得的细胞群体中至少包含65%的SIRPα阳性细胞和10%的CD90阳性细胞。移除基板后，人源工程化心肌组织（HECTs）在生物反应器内自发组装。成熟且致密的HECTs可明显偏转集成的力传感支柱，产生的力平均为5至15微牛顿。

通过颤搐力测量可揭示孤立变量如何改变这些特定工程化组织中的收缩力。在此，当组织中添加了10%的人类间充质干细胞时，在1 Hz和2 Hz的起搏频率下均观察到收缩力显著增强。一旦掌握相关技术，分化过程约需20天，细胞分选约需5小时，组织构建约需3小时。

构建完成后，还需要另外七天时间以实现正常的组织形成。在此之后，可采用其他方法，如细胞标记和组织混合物的补充，以进一步探究特定细胞间相互作用的影响，或阐明细胞治疗的作用机制。观看本视频后，您应能够充分掌握如何构建具有已知且可控细胞组成的工程化人类心脏组织。