差示扫描量热法——一种评估蛋白质抗原热稳定性和构象的方法

本实验的总体目标是在工业环境中利用差示扫描量热法评估蛋白质的热稳定性和结构构象。差示扫描量热法通过测定样品在不同温度下的摩尔热容，已被成功用于评估蛋白质的热稳定性和结构构象。该方法相对简单，不依赖于蛋白质的二级结构螺旋性或内在荧光基团，而其他许多生物物理方法则存在此类依赖性。

该技术的另一个优势在于，它能够直接测量热转变温度以及破坏维持蛋白质三级结构相互作用所需的能量。当与解折叠焓变结合使用时，热转变温度可作为监测生物制品生产工艺批次间一致性的有用参数。该方法的可视化演示可作为一种互动媒介，有效帮助新用户掌握关键步骤。

首先，打开差示扫描量热仪。然后向系统中通入氮气。这将增加样品池内的压力，以抑制样品沸腾，并防止在高温下产生气泡。

根据流通池的构成材料，按照制造商推荐的压力调节氮气供应压力，以避免损坏流通池。确保所有清洗剂储液罐均加注至所需体积。所需的清洗剂包括用于清洗流通池的洗涤剂，以及每次样品运行后用于冲洗流通池的水。

将样品保存室的温度设置为适宜的值，建议为5摄氏度，以在实验前维持样品的完整性。必须使样品与缓冲液达到平衡，以确保溶液之间的唯一差异在于蛋白质。因此，所观察到的热容差异可准确归因于蛋白质。

使用适当的蛋白质浓度测定方法（如Lowry法）确定蛋白质样品的浓度。对于本实验方案所用的仪器，建议的工作浓度范围为每毫升0.5至1毫克蛋白质。将样品对实验中用作参比的缓冲液进行透析。

将样品和参比缓冲液在真空条件下脱气，以去除可能引起体积不准确的微小气泡。在层流生物安全柜中操作，使用微量移液器和无菌吸头，将样品与其相应的缓冲液成对加入96孔板中。前两对孔中加入缓冲液，用于进行缓冲液-缓冲液扫描，以在样品测量前验证仪器的适用性。

在最后两对孔中加入水，用于水扫描以清洗细胞。然后用密封膜覆盖96孔板。在将孔板移出生物安全柜之前，确保各孔已正确密封，以避免样品污染。

最后，将培养皿以正确的方向放入样品仓中。使用采集软件，按照培养皿加载的顺序输入样品信息。如有，输入蛋白质浓度。

否则，在进行数据分析之前，将浓度输入分析软件。选择在每次样品扫描前用去垢剂清洗样品池的选项。清洗后应进行多次水冲洗步骤，以确保样品池中无去垢剂残留。

将实验的起始温度设定为20摄氏度，该温度可根据样品性质进行调整。对于已知蛋白质，可使用预设的起始温度；而对于未知样品，则可采用较低的起始温度。然后设定实验的终止温度。

最终温度也可能根据对样品的已有了解而有所不同。接下来，设置实验的扫描速率。建议在不同扫描速率下对未知样品进行扫描，以评估其解折叠的动力学特性。

设置采集软件以重新扫描样品，以检测热转变的可逆性。如果第二次扫描得到的焓值至少为第一次扫描焓值的80%，则认为蛋白质的解折叠过程是可逆的。将实验后恒温器设定为10摄氏度，以保持量热计池的完整性。

在执行实验前，确认实验设置参数正确无误。若所有条件均已具备，则开始实验。实验结束后，按照文本方案中所述进行数据分析。

分析时，需手动进行基线扣除。此步骤的一致性对于获得可比较的结果至关重要。此处显示的是包含缓冲液和水扫描的实验运行代表性原始数据。

待分析的样品为毒素的天然状态和脱毒状态。各样品的扫描数据被分别处理，以获得每种样品的熔解温度和焓值。对于天然状态，其熔解温度为 55.55 摄氏度，毒素的焓值为 3.157 × 10⁵ 卡路里/摩尔。

相反，该毒素在脱毒状态下的熔解温度为81.21摄氏度，焓值为3.656 × 10⁵卡路里/摩尔。对毒素在天然状态和脱毒状态下处理后的数据进行叠加显示，根据熔解温度数值，脱毒样品比其天然状态具有更高的热稳定性。这同时也表明，脱毒过程导致了毒素三级结构的构象变化。

在进行该实验操作时，必须注意提供充足的洗涤剂和水，以防止细胞与注射器之间的交叉污染，因为它们的洁净度对获得准确结果至关重要。观看本视频后，您将充分理解差示扫描量热法作为一种评估蛋白质热稳定性和构象的方法。您还将能够从所得的热变性曲线中做出有意义的推断。

完成此操作后，可进一步采用其他方法（如圆二色性）来探究蛋白质去折叠过程中二级结构变化的相关问题。通过收集同一产品多个批次的数据，已建立经验基线，用于分析工艺变更、配方及储存条件对疫苗生产中蛋白质抗原结构构象的影响。