利用高内涵成像技术定量测定贴壁细胞中的靶点结合

该方法有助于解答化学生物学和药物发现中的关键问题，例如：您的化合物是否会与靶标蛋白结合？该技术的主要优势在于无需使贴壁细胞脱落。

并且可以通过成像确定空间定位。尽管我们已在细胞系中应用了该方法，但此方法也可用于其他细胞系统，如原代培养和共培养。在接种细胞之前，将黑色384孔成像分析板置于组织培养罩内，并在使用标准钻头于每块板两端各钻三个直径为3.5毫米的孔之前，用铝箔覆盖这些板。

当培养板准备就绪后，使用无菌技术用 5 至 10 毫升 PBS 洗涤 A-431 细胞培养物，并在 37 摄氏度下用 2 毫升胰蛋白酶孵育细胞，直至细胞脱落。计数后，将细胞用培养基稀释至每毫升含 5 × 10⁴ 个细胞，并向每块检测板的每个孔中接种 40 微升细胞悬液。

接种后轻轻左右摇晃每块培养板，以确保细胞均匀分布在孔底。为尽量减少板边缘效应，将培养板置于超净台后部，于室温下静置20分钟，使细胞沉降至培养板底部，随后将培养板放入定制的加湿培养箱中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养两至三天。实验当天，使用酶标洗板机从每个孔中吸去培养基。

向相应的实验孔中加入30 µL目标化合物，使其达到适当的实验浓度。使用透气性板封膜密封已处理化合物的检测板，并将板放回细胞培养箱中孵育30分钟。

为了使细胞接受热刺激处理，首先将水浴锅设定至适当的实验温度，并将一个未密封的对照板放入水浴中，该对照板每孔所含培养基体积需与实验板一致，同时放入热电偶温度计以监测孔内温度。当达到目标实验温度后，从每块实验板上移除透气密封膜，并使用紧密粘附的铝箔重新密封，以确保在后续水浴加热过程中无水分渗入孔内。同时需保持板框上的通气孔可接触。

将检测板和一块新的假板放入水浴中，使板的底部朝向水面倾斜，以排出板下方残留的空气，同时开始监测新假板的温度。板的均匀受热对检测性能至关重要。将板放入水浴时需小心操作，确保板下方无气泡残留。

三分钟后，立即将平板放入室温水浴中冷却五分钟，然后再进行分析。为了成像细胞，首先向检测平板中直接加入10微升16%多聚甲醛，在室温下孵育20分钟。固定结束后，在平板洗涤仪中用300微升PBS洗涤细胞，并加入20微升0.1% NP40，在室温下孵育10分钟。

孵育结束后，按所示方法洗涤细胞。然后在室温下用15微升1%牛血清白蛋白（BSA）封闭细胞，封闭时间为1小时。接下来，使用酶标洗板机吸去封闭液，向相应的孔中加入10微升目标一抗，在室温下孵育1小时。

孵育结束后，用 300 微升 PBS 洗涤每个孔，并在避光条件下于室温加入 10 微升相应的二抗，标记 1 小时。为进行细胞核染色，在室温下向每个孔中加入 10 微升合适的细胞核染料，孵育 10 分钟。然后按照所示方法用 PBS 洗涤细胞。

每孔加入 10 µL Cell Mask 染料，室温孵育 30 分钟对细胞进行标记。随后用 PBS 最后洗涤一次。然后每孔加入 60 µL 新鲜 PBS，并用铝箔密封培养板，直至成像。

为了成像细胞，使用高内涵成像仪在10倍物镜下，通过自动激光对焦并结合适当的荧光通道，每孔采集四幅图像，并在采集过程中应用像素合并。然后将图像连同元数据一起存储为16位灰度点阵TIFF文件。抗体识别不应因配体结合可能引起的靶蛋白构象变化而受到干扰。

例如，BIRB796 具有较慢的解离速率，因此只有通过抗原修复步骤才能实现对靶点结合的定量。本实验展示了经阳性与阴性对照化合物处理后的细胞的代表性热聚集曲线，说明了在不同温度下用化合物处理细胞后典型的蛋白质稳定化范围。此处展示了一项典型的等温剂量-反应指纹实验，用以演示实验化合物在不同剂量下引起的蛋白质稳定化的代表性范围。

采用等温热挑战方法进行化合物筛选，以鉴定靶蛋白的新型结合物，可在单次实验中于单一浓度下分析大量化合物，随后对筛选出的阳性化合物进行等温剂量反应指纹分析，以确认其对靶蛋白的稳定作用。在实施该实验流程时，需注意精确的实验条件（如热挑战的持续时间与温度）会影响化合物活性的观测结果。切记，使用多聚甲醛具有极高的危险性。

进行该操作时，应始终采取预防措施，例如遵循机构的安全指南。