研究天然肠道和三维培养的Caco-2细胞中上皮转运蛋白功能与表达的方法

本实验方案的总体目标是在三维条件下培养肠道Caco-2细胞，并演示在研究5-羟色胺转运体（SERT）调控时使用尤斯室（Ussing chamber）的方法。此处展示的方法可回答上皮转运领域中的关键问题，例如肠道5-羟色胺转运体SERT是如何被调控的。三维Caco-2细胞模型的主要优势在于，相较于单层培养，其能更准确地反映细胞间以及细胞与细胞外基质之间的相互作用。

Ussing室技术可实现对肠上皮转运功能的精确测量。三维Caco细胞培养的应用拓展至治疗药物的发现领域，因为这些模型可用于筛选针对转运功能异常相关疾病的治疗剂。尽管该方法有助于研究5-羟色胺转运体的调控机制，也可应用于其他电解质转运体（如钠离子和氯离子转运体）的研究。

这些技术的可视化演示至关重要，因为剥离血清肌层以及将肠黏膜安装到尤西 chamber 中均难以掌握。3D Caco-2 细胞实验操作将由本团队的讲师 Ishita Chatterjee 和博士后研究员 Anoop Kumar 进行演示。从小鼠回肠剥离血清肌层的操作将由我实验室的高级研究专家 Sangeeta Tyagi 进行演示。

此外，来自我实验室的指导教师 Shubha Priyamvada 和 Arivarasu Natarajan 将演示剥离黏膜的安装以及将其放入尤斯灌流室的操作。首先，在4°C冰箱中将去除了生长因子的凝胶状蛋白溶液置于冰上过夜解冻。解冻后，准备1毫升或500微升的等分试样。

在培养当天，将八孔载玻片置于冰上预冷。随后，向八孔载玻片的每个孔中加入30微升胶状蛋白溶液，并均匀铺展。在将胶状混合物接种至载玻片或培养板孔中时，应小心避免产生气泡，以免细胞脱落。

将培养皿放入37摄氏度的细胞培养箱中孵育15至30分钟，使溶液凝固。接着，使用胰蛋白酶将融合生长的Caco-2细胞从培养瓶中消化下来。然后，在血细胞计数板中对细胞进行计数，并在4摄氏度下以500 × g离心5分钟。

用3D Caco-2培养基重悬所得的细胞沉淀，以获得所需密度的细胞悬液。取制备好的细胞悬液，每孔接种4,000个细胞至玻璃腔室载玻片上，于37°C、含5%二氧化碳的湿化培养箱中培养12至14天。染色时，首先吸除培养基，然后用400微升2%多聚甲醛（PFA）固定细胞。

在室温下继续固定细胞20分钟。用PBS洗涤细胞两次后，用含0.5% Triton的PBS溶液对细胞进行通透处理，时间不超过15分钟。用PBS甘氨酸缓冲液冲洗细胞两次，然后将通透后的细胞在IF缓冲液中于室温下洗涤10分钟。

使用含5%正常山羊血清的IF缓冲液封闭细胞。然后，在室温下用200微升IF缓冲液稀释的一抗溶液（含1%山羊血清）孵育细胞1至2小时。孵育结束后，用IF缓冲液洗涤细胞3次。

将洗涤后的细胞与200微升用免疫荧光缓冲液稀释的二抗（含1%山羊血清）在室温下孵育一小时。用免疫荧光缓冲液洗涤细胞三次，每次十分钟。为从玻片上分离腔室，请先将玻片放入玻片架中，然后将白色撬片插入架中，直至其接触孔的边缘。

轻轻拉动小室，将其从载玻片上取下。使用带盖的黑色盒子保护载玻片免受光照。用抗荧光淬灭封片剂封片，并加盖盖玻片。

将载玻片在室温下干燥10分钟后，用指甲油封片，再进行成像。按照文本方案中所述步骤分离小鼠回肠。然后，用剪刀沿纵轴切开肠道。

将所得组织切片置于含有一微摩尔吲哚美辛的冰冻通气KBR缓冲液中孵育十分钟。将长约一厘米的肠段（黏膜面朝下）固定在含有0.5厘米厚7%琼脂糖或固化硅橡胶的培养皿上。使用配备底部照明的解剖体视显微镜，剥离浆膜肌层。

然后，用羽毛状手术刀片切开浆肌层。用精细镊子沿肠管纵轴提起该层边缘。最后，小心地将黏膜固定在切片滑动器的针上。

握住剥离的黏膜组织边缘，避免撕裂。将剥离的回肠黏膜固定在载片的针头上时，应注意防止在针头处撕裂组织，并尽量减少对组织边缘的损伤。在处理组织前，应准备好用95%氧气和5%二氧化碳混合气体饱和的克雷布斯（Krebs）溶液。

然后，将溶液倒入Ussing chamber中。在浆膜侧浴液中加入10 µM葡萄糖作为能量底物，在黏膜侧浴液中加入10 µM甘露醇以维持渗透平衡。随后，将固定有黏膜的滑片插入 chamber 中，使组织的顶膜侧和基底外侧均暴露于Krebs溶液中。

将回肠组织在浴液中平衡10分钟。然后，在测量黏膜至浆膜方向转运量时，先用10微摩尔的氟西汀处理组织的顶端侧30分钟。最后，用10纳克/毫升的TGF-β1处理组织的基底外侧1小时，随后在顶端侧加入20纳摩尔的氚标记5-羟色胺孵育30分钟。

为计算黏膜至浆膜的转运速率，从浆膜侧储液器中收集 0.75 毫升等分试样，并以相同体积的灌流液替代，以防止黏膜两侧产生静水压差。为定量测定组织中积累的氚标记 5-HT，将黏膜从载物片上取下，用冰冻的 KRB 缓冲液洗涤一次，然后放入玻璃培养管中。

将黏膜在 0.5 毫升 10% KOH 中于 37 摄氏度孵育过夜，以裂解组织。然后，使用液体闪烁计数器对裂解液的 150 微升等分试样进行放射性测定，每份样品测定三次。采用 Bradford 法测定裂解液中 3 至 5 微升等分试样的蛋白质浓度。

图中显示的是在三维培养条件下生长的Caco-2囊泡，经肌动蛋白染色，以及同时进行肌动蛋白、细胞核和SERT蛋白染色的Caco-2三维囊泡。SERT可见于管腔膜及顶膜下区室。为进一步证实Caco-2三维球体相较于二维Caco-2单层细胞的优势，进行了SERT蛋白表达的蛋白质印迹分析。

结果显示，与2D培养的Caco-2细胞相比，Caco-2 3D球体中SERT蛋白的表达增强。最后，采用Ussing腔室系统证明TGF-β可增加黏膜到浆膜侧的转运通量，反映出从管腔膜摄取5-HT的增加以及在回肠黏膜中观察到的5-HT积累增强。这些发现得到了以下观察结果的支持：5-HT摄取对氟西汀处理的敏感性，与管腔膜上SERT的表达相对应。

掌握该技术后，剥离并安装回肠黏膜的操作可在15分钟内完成。在采用该方案时，需注意从动物体内取出后，肠外肠道组织的活性有限，通常最多维持三小时。3D Caco-2 囊肿可用于多种研究，例如膜转运事件、基因表达或上皮转运蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用。

该3D Caco-2技术建立后，为肠道转运领域的研究人员探索液体运动以及研究动脉性疾病病理生理学提供了新的途径。请务必注意，接触放射性物质可能具有极高危险性，因此必须采取预防措施，例如使用个人防护装备（PPE）并严格执行去污程序。观看本视频后，您将能够培养3D培养条件下的Caco-2细胞，并利用这些细胞模型研究上皮转运蛋白的表达。

您还将能够利用尤辛室研究天然小鼠肠道中的5-羟色胺转运功能。