利用运动训练后血清处理韧带类组织：一种可转化的组织工程模型

该模型的总体目标是确定运动和营养对结缔组织合成与功能的影响。该技术利用运动前后采集的人体血清处理三维组织，从而帮助我们理解运动如何影响韧带和肌腱的功能。三维组织模型结合了体外实验可精确表征的优点，以及体内组织在功能、形态和生物化学特性方面的优势。

根据文本方案预先制备硅涂层35毫米培养皿后，通过将一根微细针置于每个多孔模具圆柱形孔的中心来制备锚定模具。在冰上的塑料称量皿中，按每毫升1至3克的比例将β-磷酸三钙与正磷酸柠檬酸溶液混合。使用塑料细胞刮刀剧烈搅拌水泥混合物。

继续研磨水泥以完成混合，将混合物用移液管转移至模具中，然后以2,250 × g离心5分钟。离心后，将磷酸八钙水泥锚在室温下静置过夜使其固化。次日早晨，从模具中取出锚，并在每块硅涂层板上以12毫米的间距固定两个锚。

用70%乙醇喷洒固定好的培养皿，使培养皿及其盖子内部均被乙醇充满，进行灭菌处理，然后将培养皿放入生物安全柜（BSC）中。至少30分钟后，吸去乙醇，让培养皿在生物安全柜内晾干。盖上皿盖，并将其保存在生物安全柜内，直至使用。

遵守当地生物危害法规，正确使用和处置生物危害性材料。保持无菌条件，在生物安全柜中进行构建物的制备步骤。根据文本方案，在制备原代成纤维细胞、试剂以及带有固定二水磷酸氢钙锚的硅涂层培养板后，将细胞接种于15厘米培养皿中，培养至70%汇合度。

接下来，配制主混合液，每份构建物包含以下成分：681 微升细胞悬液、29 微升凝血酶、2 微升抑肽酶和 2 微升氨基己酸。充分混合溶液后，以绕过磷酸氢钙水泥锚点的“8”字形模式，将 714 微升主混合液加入每个固定的孔板中，确保主混合液直接接触锚点的侧面。轻轻敲击每个孔板，使混合液均匀分布。

最关键的步骤是形成细胞附着的纤维蛋白凝胶。确保细胞附着主混合液直接接触锚点，并轻敲培养板以使混合物均匀分布。每次处理一块培养板，以逐滴方式将286 µL纤维蛋白原均匀地加入培养板表面。

立即前后左右滑动培养板，使纤维蛋白原均匀分布，形成细胞包埋的纤维蛋白凝胶，然后继续处理下一块培养板。将构建物置于无菌培养箱中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育，至少孵育15分钟，以使纤维蛋白原聚合。通过在生长培养基中添加200微摩尔抗坏血酸、50微摩尔脯氨酸和5纳克/毫升TGF-β1，为每个构建物准备2毫升喂养培养基。

使用 2 毫升培养基覆盖每个构建物，并将构建物置于无菌培养箱中，在 37 摄氏度及 5% 二氧化碳条件下培养，总培养时间为 14 天，或根据实验需求确定终点时间，每隔两天用 2 毫升新鲜培养基更换一次。为采集人血清，首先按照文本方案采集静息状态下的血液样本，随后让受试者进行符合研究目标的运动方式。图中展示的是一次持续 30 分钟的高强度抗阻运动。

运动结束后15分钟采集血样，待血液凝固后，以1,500 ×g离心10分钟。在无菌条件下，将血清转移至无菌管中用于培养基制备。韧带构建物制备完成后，在PBS溶液中使用拉力测试仪进行拉伸测试，夹具为与力传感器相连的反向模制夹具。

这可在测试期间固定磷酸氢钙水泥锚。使用数显卡尺测量韧带构建物的长度和宽度，并计算组织的横截面积。将韧带构建物从平板上取下，将锚放入反向模制的夹具中，确保构建物浸没在磷酸盐缓冲液（PBS）中，然后调节夹具间的距离，将构建物的长度设定为其初始长度。

开始测试，并以0.4毫米/秒或3%/秒的应变速率拉伸构建物直至其断裂。测试完成后，按照文本方案对组织进行处理，并对工程化韧带进行胶原定量分析。培养1至2天后，前交叉韧带成纤维细胞已附着于纤维蛋白凝胶，伸出细胞突起，并开始施加牵引力。

在两个锚定点之间产生张力，细胞沿此轴线平行排列，并开始沉积胶原蛋白。图中显示的是韧带在拉伸至断裂时具有代表性的应力-应变曲线。在这些实验中，从运动前和运动后的血液样本中分离出人血清，并用其替代FBS，以制备富含运动诱导生化环境的培养基。

如图所示，在为期14天的培养后，韧带构建物在运动后血清刺激下，其最大抗张载荷和胶原含量均显著增加。一旦掌握该技术，韧带构建物可在两天内制备完成，并在两周后即可进行抗张强度测试、胶原含量定量以及其他生化分析。这种可转化的体外-体内模型，是更广泛研究目标的一部分，旨在阐明运动如何改善韧带、肌腱乃至体内几乎所有组织的功能。

因此，这是一种非常可靠且强大的技术，可用于评估在运动、营养、负荷、各类生长因子以及人类或动物可实施的各种干预措施处理后，胶原蛋白含量和结缔组织功能的变化。