一种基于G-四链体DNA亲和力的方法用于纯化具有酶活性的G4解旋酶1

本方法的总体目标是利用一种独特的ATP依赖性纯化步骤，从细菌表达系统中分离出G-四链体解旋酶G4 Resolvase1蛋白，从而获得近乎纯度高且具有催化活性的酶。该方法可帮助研究人员获得近乎纯化且具有催化活性的重组G4 Resolvase1蛋白，用于多种体外生物化学分析。该技术的主要优势在于能够从蛋白制备物中去除错误折叠或无催化活性的酶分子。

使用ATP洗脱G-四链体解旋酶的想法源于无法通过极高盐浓度将具有催化活性的酶从G4珠粒上洗脱下来。按照文本方案所述，准备并培养大量表达G-四链体解离酶1（G-quadruplex Resolvase1）或G4R1的大肠杆菌培养物。在室温下，用三毫升TN缓冲液重悬细菌沉淀。

用手握住瓶子，轻轻旋转以融化并重悬细菌沉淀。待完全融化且菌体大致均匀悬浮后，用TN缓冲液将体积调至五毫升。接着，每份培养物中加入250微升水溶解20毫克溶菌酶，并将该溶液加入重悬的细菌中。

用手轻轻旋转瓶子，使溶菌酶消化细菌约 5 到 10 分钟。随着消化的进行，悬浮液的颜色会略微变浅，且悬浮液的黏度相对较低。加入 250 µL 蛋白酶抑制剂混合物（简称 PIC）。

然后，加入一份数量为10 µL的亮抑蛋白酶肽（leupeptin），并充分混匀。将悬浮液置于冰上，加入10 mL冷TN缓冲液和22 µLβ-巯基乙醇（BME）。将悬浮液转移至50 mL离心管中。

将细菌置于冰上，使用数字超声波破碎仪进行超声处理，超声功率设为30%。以开启2秒、关闭2秒的脉冲模式持续1分钟。重复超声处理三次，每次超声之间将样品置于冰上冷却至少2分钟。

接着，加入等体积预冷的4倍浓度的柠檬酸钠盐水（SSC）缓冲液以及BME、PIC和亮抑蛋白酶肽，混匀悬浮液。在已预冷至4摄氏度的台式离心机中，以2,300 × g离心20分钟。然后将上清液转移至预冷的新鲜50毫升离心管中。

取一毫升链霉亲和素磁珠（SPB）悬浮液用于每份培养物，转移至1.5毫升微量离心管中。使用磁铁沉淀SPB，然后用两倍浓度的SSC缓冲液（含5毫摩尔EDTA，pH 8）洗涤SPB两次。

接下来，将洗涤后的SPB重悬于200 µL相同溶液中。向SPB悬液中加入一个三倍OD的G4 DNA等分试样。通过反复吹打数次，快速混匀。

然后，将试管置于旋转仪上，在室温下旋转至少30分钟。旋转结束后，通过加入1毫升0.4%乳白蛋白封闭与G4结合的SPB，并置于冰上保存，直至后续使用。为使组氨酸标签重组G4R1蛋白结合钴珠，向每个含有澄清细菌裂解液的50毫升试管中加入1毫升钴珠悬液。

将混合物在旋转仪上室温孵育20分钟。孵育结束后，在4 °C的台式离心机中以110 ×g离心5分钟，使钴珠沉淀。小心吸除上清液，保留数毫升液体，以免扰动沉淀的钴珠。

然后，用10至15毫升冰冷的4 × SSC缓冲液（含BME）洗涤磁珠，并像之前一样收集磁珠。将下一步澄清的裂解液加入到沉淀的钴磁珠中。在旋转仪上室温孵育20分钟，再用10至15毫升4 × SSC缓冲液（含BME）洗涤磁珠。

然后，在 4°C 条件下，以 100 × g 离心 5 分钟，使磁珠沉淀。第二次洗涤后，吸除上清液，保留约 2 毫升含有磁珠和液体的混合物于离心管底部。使用 1 毫升宽口吸头，将结合有蛋白的钴磁珠转移至预冷的 2 毫升离心管中。

将两毫升离心管中的珠子在4°C下用微量离心机高速短暂离心。小心吸取并弃去上清液，注意避免丢失与蛋白质结合的钴珠。用移液器加入0.5毫升组氨酸洗脱缓冲液（HEB），通过倒置离心管轻轻重悬珠子。

然后将钴珠置于HEB中，在4°C的旋转仪上孵育5分钟。接着，在4°C下以18,000 ×g离心1分钟。小心吸取含有蛋白的上清液，使用移液器轻柔操作，留下少量液体覆盖在钴珠表面。

将上清液转移至预冷的15毫升离心管中。重复上述步骤，共进行三次HEB洗脱。然后用0.2摩尔EDTA（pH 6.0）洗脱一次。

随着EDTA螯合钴离子，钴珠的颜色会从粉红色变为白色。在将第四次也是最后一次洗脱液转移至15毫升离心管后，使用1毫升移液枪尖端的加样胶头吸头吸取钴珠中残留的洗脱缓冲液。将吸头插入管底，可收集含有残留蛋白质的洗脱缓冲液。

将制备好的 G4 SPB 用磁铁吸附至管壁一侧，弃去上清液。然后，向 G4 SPB 中加入 1 毫升 3× 洗涤缓冲液，用移液器吹打混匀。将悬浮在 3× 洗涤缓冲液中的 G4 SPB 用移液器转移至含有约 2 毫升含蛋白 HEB EDTA 的 15 毫升管中。

将样品在37摄氏度水浴中孵育15分钟，期间偶尔轻轻振荡，以防止磁珠沉降。按照文本方案洗涤与蛋白结合的G4 SPB后，将G4 SPB置于冰上，用磁力架收集磁珠，并将磁珠重悬于100 µL预热的洗脱缓冲液中。立即转移磁珠至预热的PCR管，于37摄氏度孵育30秒。

立即加入 12 微升 5 摩尔的氯化钠，并用移液器上下剧烈吹打 20 至 30 次。高盐浓度和洗脱缓冲液中的 ATP 共同作用，可将重组 G4R1 从 G4 珠中洗脱下来。立即用磁铁沉淀 G4 SPB，并将含有蛋白的洗脱液转移至冰上新的 PCR 管中。

重复洗脱并转移后，最终产物约为200微升含有纯化重组G4R1的洗脱缓冲液。最后，进行质量控制的酶活性检测，以验证是否已如文本方案所述纯化得到高活性的重组G4R1。G4检测可定量重组G4R1的酶活性。

在酶促反应中，当体积处于 0.2 至 0.013 微升范围内时，通常可观察到 0.2 皮摩尔的四甲基罗丹明标记的四分子 G4 DNA 有 50% 转化为单体。纯化的重组 G4R1 蛋白经考马斯亮蓝染色显示，在预期的 120 千道尔顿大小处出现单一主条带，同时在约 75 千道尔顿处有一条微弱的污染条带。该条带可能代表截短的重组 G4R1，其仍保留了结合 G4 DNA 磁珠的能力，并能以 ATP 依赖的方式被洗脱。

通过蛋白质标准曲线对目标条带进行定量。该方案通常每升细菌培养物可获得 200 微升浓度为 20 至 100 纳摩尔的纯化酶。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用独特的 ATP 依赖性纯化步骤，从细菌表达系统中纯化出近乎纯度高且具有催化活性的 G4 解旋酶1 蛋白。

掌握相关技术并预先准备好冷冻细菌沉淀后，重组G4R1的纯化可在约六小时内完成。为保持酶的最佳催化活性，在未特别说明的情况下，操作过程中样品需始终置于冰上。务必使用蛋白酶抑制剂。

避免在试管中产生气泡。快速冷冻纯化的酶，并避免不必要的冻融循环。该技术建立后，为该领域的研究人员准确界定该蛋白与多种DNA和RNA底物的结合亲和力及解旋酶活性奠定了基础。

该方法还可适用于其他ATP依赖性核酸酶的纯化，其酶促反应产物不再作为该酶的结合底物。