DNA双链的迭代优化以促进SeqA-DNA复合物的结晶

本实验详细介绍了如何获得含有串联半甲基化 GATC 重复序列的蛋白质-DNA 复合物的衍射级晶体，以促进蛋白质-DNA 复合物的晶体堆积。首先合理设计 DNA 长度、GATC 间距和 DNA 末端，接着使用互补的单链寡核苷酸纯化 DNA，然后退火形成半甲基化 DNA 双链，最后加入纯化的 SeqA 蛋白以形成复合物。

接下来，通过使用商业化稀疏矩阵筛选试剂盒进行结晶试验，寻找生长蛋白质-DNA复合物衍射级晶体的最优条件。展示实验结果，并分享DNA长度、GATC间距及末端结构的变化对CQ A DNA晶体衍射质量的影响。

本研究的目标是获得可用于衍射分析的CK与DNA复合物晶体，同时也有助于理解在设计用于其他蛋白质-DNA复合物结晶的DNA双链时需要考虑的一般变量。本实验操作流程将由我实验室的博士生Chang, A使用。本研究采用了一种DNA复制调控蛋白的变体——Seek a，该蛋白可形成稳定的二聚体，并且其二聚化结构域与DNA结合结构域之间的连接区较短。

该变体将DNA结合限制在由DNA上相隔一个完整螺旋的串联GATC重复序列上。首先，用含有在T7启动子控制下编码DEMETRIC seq A的质粒转化BBL 20 1D三型细胞。将转化反应物涂布于含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，并置于细菌培养箱中过夜培养。挑取混合菌落，开始小规模过夜培养。

第二天早晨，用10毫升过夜培养的接种物接种一升培养液。当培养物处于对数生长期时，加入2毫升0.5摩尔的IPTG以诱导蛋白表达。随后在37摄氏度的摇床中继续培养三小时。

然后在3,300 ×g条件下离心10分钟，收集细胞。将细胞沉淀重悬于纯化缓冲液中，通过超声处理裂解细胞，并在39,000 ×g条件下离心40分钟，清除裂解液。随后将上清液上样至已用纯化缓冲液平衡的肝素柱中。

为了洗脱CK蛋白，使用线性梯度洗脱至1摩尔氯化钠，CK蛋白在约0.7摩尔氯化钠时被洗脱。收集含有CK的组分，并进行稀释以降低样品的离子强度。

然后将样品上样至已用纯化缓冲液平衡的阳离子交换层析柱E。施加线性盐梯度以洗脱纯化的CK蛋白，洗脱峰约在0.4摩尔氯化钠处。合并含有CK的组分。

浓缩至三毫克每毫升，并在储存条件下保存。设计缓冲液以配对未甲基化和甲基化的寡核苷酸。将每种冻干的单链DNA各一微摩尔溶于800微升经高压灭菌的双蒸水中，涡旋混匀，静置15分钟，现配800微升。

对于长度为20至30个核苷酸的寡核苷酸样品，向每个样品中加入两倍体积的上样缓冲液并预先加热。制备一块较大的10%变性凝胶。待凝胶聚合后，取出梳子，并彻底冲洗加样孔。将凝胶组装好，用一倍TBE电泳缓冲液注满上下两个电泳槽。

以750伏预电泳，使凝胶升温至55摄氏度。然后停止电泳，并用运行缓冲液彻底冲洗加样孔。现在将寡核苷酸在90摄氏度加热两分钟。

涡旋并离心。立即将样品上样至凝胶中。以约700伏电压电泳，直至寡核苷酸迁移完毕。

在10%聚丙烯酰胺凝胶中，溴酚蓝的迁移位置相当于约20个碱基长度的寡核苷酸，而二甲苯蓝的迁移位置相当于约60个碱基长度的寡核苷酸。将凝胶从装置上拆下，并在平坦表面上移除垫条。取下一块玻璃板，用塑料膜覆盖凝胶。

然后将凝胶翻转，取下另一块玻璃板，并用塑料膜覆盖凝胶。接着，使用紫外光和凝胶背后的荧光板标记条带。用剃刀观察DNA阴影，切下目标条带并将其切成小块。

将每个样品转移至无菌的15毫升离心管中。加入9毫升洗脱缓冲液，在37摄氏度下振荡过夜进行稀释。使用加样枪头小心地将溶液转移至高压灭菌的离心管中。

为避免转移丙烯酰胺碎片，加入1 mL 3 mM乙酸钠（pH 7）和25 mL预冷的100%乙醇，在-20 °C孵育至少3小时。离心沉淀DNA，然后在中等加热条件下用真空浓缩仪干燥沉淀物，将每个沉淀重悬于400 µL经高压灭菌的双蒸水中，并转移至新的离心管中。

加入40微升pH为7的3摩尔醋酸钠和1毫升100%乙醇，涡旋混匀，在-20摄氏度孵育30分钟，然后在18,000 ×g条件下离心15分钟。用100微升70%冷乙醇洗涤DNA沉淀，以去除残留盐分，在18,000 ×g条件下离心6分钟，弃去乙醇，并在真空浓缩仪中干燥沉淀。

现在将每个沉淀重悬于100 µL经高压灭菌的双蒸水中。通过分光光度法测定寡核苷酸的浓度。为制备半甲基化DNA双链，首先将等摩尔浓度的互补单链混合。

然后将混合物置于水浴中加热至95摄氏度，持续5分钟，以变性DNA双链。让样品在水浴中缓慢冷却至室温。取等体积的81微摩尔纯化的CQ蛋白与81微摩尔半甲基化DNA混合。

然后在室温下孵育15分钟。将样品储存于4摄氏度直至使用，并利用商业化的稀疏矩阵筛选试剂盒筛选结晶条件。一旦确定初步的结晶条件，需优化条件以获得可用于衍射的晶体。对所得的CK DNA晶体进行冷冻保护处理。

可将结晶溶液中 PEG 400 的含量增加至终浓度 25%，或向结晶溶液中加入 20% 甘油。用尼龙环快速捞取单个晶体。将样品在液氮中冷冻。

现在在 100 K 下测试每颗晶体的衍射极限。为了获得与半甲基化 DNA 结合的 CK 截短突变体的晶体结构，我们连续优化了 DNA 上的三个参数：半甲基化 GATC 序列之间的间距、双链的长度，以及是否存在 5' 突出端。本研究使用了一种 DME 变体的 seek a，其末端结构域存在点突变，可防止进一步的连接化，同时采用缩短的连接子，以限制 DNA 结合于串联重复序列。

DNA电泳迁移率变动实验显示，GATC重复序列之间仅相隔一个螺旋时，经修饰的CK蛋白优先结合间隔为9至10个碱基对的GATC重复序列。因此，初步筛选采用长度为23至24个碱基对的双链，其中包含两个半甲基化的GATC重复序列，且重复序列之间间隔9个或10个碱基对。

三个双链体均获得了形态良好的晶体。尽管这些晶体均未达到高分辨率衍射，但数据表明，A-G-A-T-C 间隔九个碱基对的结构更有利于结晶，出乎意料的是，在两个 GATC 位点之间引入一个 CG 二核苷酸增强了沟槽与骨架的相互作用，但并未改变晶体的衍射极限。

相比之下，优化突出端的长度显著改变了分子间接触和晶体形态。该CK蛋白与半甲基化DNA双链结合的晶体结构证实，尽管蛋白质与DNA的相对尺寸较大，DNA双链的游离面并未参与晶体接触，大多数对称相关分子间的相互作用均由蛋白质介导，包括蛋白质-蛋白质以及蛋白质-DNA相互作用。有趣的是，在此特定情况下，5'端二核苷酸突出端的有利效应并非源于形成拟连续DNA结构。

相反，甲基化链的5'端从DNA轴向外延伸，并与复合物中相邻的CK分子相互作用，这解释了为何严格需要两个核苷酸来改变晶体堆积方式。观看本视频后，您应能够充分理解如何纯化蛋白质以及设计用于蛋白质-DNA复合物结晶的DNA双链。需要牢记的是，尽管本实验方案旨在用于CK-DNA复合物的结晶，但对DNA长度、序列和末端进行理性优化的方法，为其他蛋白质-DNA复合物结晶所用DNA双链的设计提供了通用框架。