胚胎血管生成的可视化与定量分析 Xenopus tropicalis

本实验的总体目标是可视化热带爪蟾（Xenopus tropicalis）蝌蚪的血管系统。该方法有助于回答心血管生物学领域的一些关键问题，例如血管生成是如何被调控的。该技术的主要优势在于，通过简单的荧光染料注射，即可在完整且状态良好的胚胎中观察到血管结构。

首先，使用微量加样器将约五微升透明的DiI乙酰化LDL溶液吸入一根锥形玻璃微量移液管中，注意避免吸入任何沉淀颗粒。在解剖显微镜下，使用一对精细的55号镊子剪断移液管尖端，以调节所加载复合物的体积，并设置压力控制注射系统，使每次注射约五纳升溶液。然后将移液管尖端浸入定制的Sylgard模具中的0.04% MS-222溶于0.1X改良巴特氏生理盐水（MBS）的溶液中。

接下来将热带爪蟾（Xenopus tropicalis）胚胎转移至Sylgard模具中，并通过背鳍刺激无反应来确认胚胎已完全镇静。在解剖显微镜下，将胚胎腹侧朝上置于模具的V形凹槽内，位置稍呈斜向。将两枚0.1毫米的微细针紧密固定于持针器上，用其中一枚针刺穿心脏上方的皮肤，此时心脏应可见搏动。

将针从心脏与组织之间的空隙处的小孔插入，注意不要刺破心脏，并将针尖置于即将切开的区域位置。然后用第二根针沿已插入的针进行摩擦，形成线性切口，并同时使用两根针轻轻扩大切口，以暴露心脏。为注射DiI乙酰化LDL溶液，将玻璃移液管尖端插入心脏，并在约10次喷射脉冲内注入50至60纳升的DiI乙酰化LDL溶液。

当所有染料溶液注射完毕后，确认心脏仍在跳动，然后将胚胎转移至一个新的含有0.1X MBS的培养皿中。5到10分钟后，蝌蚪应从麻醉状态恢复并开始活动。在完成适当数量的胚胎注射后，在荧光显微镜下目视筛选标记正确的麻醉胚胎，剔除任何其他器官被标记的个体。

标记不足的胚胎可再次进行注射。随后对正确标记的胚胎进行成像。为了更全面地观察血管，将重新麻醉的胚胎置于4%多聚甲醛中，在室温避光条件下固定1小时，以便通过共聚焦显微镜进行观察。

如果向心脏注射足量的DiI乙酰化低密度脂蛋白，则应在荧光显微镜下立即可见后主静脉（PCV）。体节间静脉（ISV）从PCV背侧以从头端到尾端的顺序依次出现，始于36期，结束于约40至41期，并在约43期时出现轻微分支。PCV和ISV以一种典型的血管生成模式生长，该过程受到严格的发育调控。

有趣的是，通过反义吗啉代寡核苷酸敲低 TIE-2 信号通路会减少 ISV 的长度和复杂性，而表达组成型活性形式的 TIE-2 则会诱导 ISV 过度分支。可通过计算静脉复杂性指数来评估 ISV 的复杂程度，并生成可视化路径以展示非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）胚胎血管系统的整体结构。该实验的原始方案由 Levin 和 Colics 针对 Xenopus laevis 建立，我们已将其优化适用于 Xenopus tropicalis。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在一小时内完成。在进行此操作前，可实施基因和药物学干预，以回答其他问题，例如哪些基因和信号通路调控血管发育。利用该方法，可在完整动物体内实时成像标记的血管系统，为研究血管发育的动态过程提供一种强有力的工具。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何将二异丙基荧光素乙酰化低密度脂蛋白（diI acetylated LDL）注射到热带爪蟾（Xenopus tropicalis）蝌蚪的心脏，以观察其血管系统。