利用天然电泳、凝胶内活性检测和电洗脱分析线粒体电子传递链的超复合物

本实验的总体目标是通过天然电泳结合凝胶内活性检测、免疫印迹以及天然电洗脱技术，保持并分析线粒体超复合物的组装状态。该方法有助于解答线粒体电子传递链中的蛋白质复合物如何根据多种因素（包括生物能量需求以及生理和病理条件）组装成超复合物。该技术的主要优势在于，若操作得当，可在漫长的分离过程中始终维持线粒体超复合物的生理完整性和功能活性。

该方法还可用于研究超复合体组装的动力学过程，并分析质膜以及其他细胞内膜中的蛋白质复合物。进行凝胶内检测实验准备时，必须确保所有用于天然电泳的器具均未被去污剂污染，因为去污剂会导致线粒体超复合体解体。从一块透明的天然凝胶中切下一至多条泳道，并将其转移至已标记的容器中。

进行复合体-1 检测时，将 10 毫升检测缓冲液与 25 毫克氮蓝四唑（nitro blue tetrazolium）及 100 微升浓度为 10 毫克/毫升的 NADH 混合。将此混合液加入已切下的透明天然凝胶条带或目标区域。在摇床中轻柔振荡至少 3 分钟后，观察蓝色条带的形成情况。

然后，用10至20毫升乙酸溶液固定凝胶，或在5毫摩尔Tris pH 7.4中洗涤以终止反应。拍摄照片以记录结果。进行复合体-5检测时，从蓝色天然凝胶或透明天然凝胶中获取凝胶、泳道或感兴趣的区域。

将样品在 10 至 20 毫升检测缓冲液中，加入或不加入 5 微克/毫升寡霉素，在室温下轻柔振荡孵育两小时。孵育结束后，更换为 14 毫升新鲜检测缓冲液。然后依次加入 190 微升 1 摩尔硫酸镁、27.28 毫克硝酸铅、60 毫克 ATP 以及 75 微升寡霉素。

在温和振荡条件下孵育，并观察白色沉淀的形成，因为寡霉素处理的凝胶中会出现非复合体5依赖性的条带。使用基于甲醇的固定液固定凝胶，因为酸性溶液会溶解铅沉淀。拍摄结果照片，随后按照文本方案中所述进行蛋白转膜和免疫印迹。

在电洗脱当天，将多孔塞放入每个待用玻璃管的底部。如有必要，可将玻璃管置于洗脱缓冲液中，从管内将多孔塞推至管底。将装有多孔塞的玻璃管插入电洗脱仪的模块中。

用洗脱缓冲液润湿垫圈，将玻璃管插入到位。确保玻璃管的顶部与垫圈齐平。用堵头封闭空的垫圈。

接下来，将一个湿润的透析膜盖置于硅胶适配器底部，并用洗脱缓冲液填充适配器。缓慢上下移液，使缓冲液和适配器反复运动，以去除透析膜周围的任何气泡。将充满缓冲液的适配器沿玻璃管滑至底部。

然后，去除玻璃管内凝胶过滤器上出现的所有气泡。用洗脱缓冲液填充每根玻璃管。将切下的BN-PAGE胶带放入玻璃管中。

将大块材料切割成较小的块状。确保玻璃管内的填充高度约为一厘米。然后，将整个模块放入容器中。

向槽中加入约 600 毫升冷洗脱缓冲液。确保硅胶接头帽浸没在缓冲液中。在冷室中进行蛋白洗脱前，先在槽底部放入一个搅拌子，并在 350 伏电压下持续洗脱四小时。

电洗脱完成后，将电洗脱模块从缓冲液槽中取出，放入水槽或容器中。如果使用了堵头，请将其移除以排空上层缓冲液室。移除每根玻璃管中的缓冲液并弃去。

确保硅胶适配器保持原位，且砂芯下方的液体未受扰动或摇晃。然后，小心地将硅胶适配器连同膜帽从玻璃管底部取下。用移液器将硅胶帽内的内容物转移至微量离心管中。

用另外200微升洗脱缓冲液冲洗硅胶帽，并将其加入微量离心管中。对所有玻璃管重复此步骤。将可重复使用的膜帽置于含有0.5毫克/毫升叠氮化钠的洗脱缓冲液中保存，并将其冷藏。

通过凝胶内检测法对心脏线粒体中的超复合体进行可视化。透明天然凝胶的泳道用于复合物1和复合物5的凝胶内检测。可通过使用抑制剂（如用于ATP合酶的寡霉素）来评估信号的特异性。

凝胶内检测可提供有关蛋白质复合物大小的信息，以及复合物1或复合物5的活性信息，但无法提供其组成成分的信息。蓝色天然凝胶可显示蛋白质复合物的条带，这些条带可被切下用于电洗脱。电洗脱后，所得洗脱液可用于进一步分析，例如凝胶内检测、通过天然或变性电泳对洗脱蛋白进行银染，以及蛋白质印迹（Western blotting）。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在三天内完成。这三天包括线粒体分离、过夜蓝色天然大胶电泳以及免疫印迹。观看本视频后，您应能充分理解如何利用天然电泳、胶内活性检测和电洗脱技术来分离和鉴定线粒体超复合物。

在进行该实验操作时，需注意线粒体超复合物较为脆弱，应尽量减少样品的冻融次数。天然电泳和电洗脱步骤应在冰上或冷室中进行。

这些技术的意义不仅限于确定每种超复合物的物理组成。由于超复合物是以其天然形式被捕获的，因此可以进行功能测定。该技术建立后，为线粒体生物学领域的研究人员重新评估线粒体电子传递活性及其对线粒体疾病患者的影响奠定了基础。

采用此方法后，还可进行高效液相色谱（HPLC）、质谱分析、电子显微镜观察或膜片钳等其他方法，以进一步探究所分离蛋白质复合物的分子组成、结构或电生理特性等其他问题。