测量母猪后代冷冻保存心脏组织中的线粒体电子传递链复合物：评估运动诱导的线粒体生物能量学变化的模型

本方案具有重要意义，因为它允许用户利用以往研究中采集并存档的冷冻组织来制备线粒体样品。该方案还可减少为获取组织而使用活体动物的需求。该技术通过采用温和的组织剪切方法，使用户能够利用先前冷冻保存的组织制备富含线粒体的样品。

该制备方法可最大程度地提高线粒体制备的得率。建议在操作前仔细阅读实验方案，以确保所有组分和工具均已备齐，特别是确保组织破碎仪的驱动装置已充满电；同时建议先使用一些废弃组织进行练习，以熟悉各操作步骤。本次实验操作将由本实验室的研究助理 Edina Kosa 进行示范。

首先，记录装有心脏组织的离心管重量。然后称量空离心管的重量，并从先前记录的重量中减去该值，以获得心脏组织的净重。将冷冻的心脏组织直接放入盛有冰浴溶液的烧杯中。

搅拌5分钟。同时用镊子轻轻按压组织，尽可能去除血液。用镊子取出组织，并用干净的滤纸轻轻挤压心脏以去除血液。

然后将组织放入另一个装有冰浴溶液的烧杯中。搅拌组织5分钟后，用纸巾轻轻吸干组织，并去除脂肪、凝固的血液、心耳和筋膜。汇集心室组织。

为了破碎组织样本，将50至300毫克的心脏组织从推杆端放入组织破碎仪的破碎腔中，并关闭推杆端。然后向管盖端加入约0.2至0.8毫升洗涤缓冲液。使用管具将破碎仪盖紧密地盖在破碎腔上，注意不要过度拧紧。

将撕碎室放入撕碎机支架单元中，使冲头侧朝下以实现卡合安装。将已充满电的撕碎机驱动器的钻头插入并卡紧到撕碎室盖中，确保钻头牢固锁定到位，然后向下施压于撕碎机驱动器，使其进入撕碎室，直至撕碎机支架上的压力指示器达到约2的设定值。按下触发开关，保持设定值为2，运行撕碎机驱动器约10至12秒。

观察离心管，确保所有或大部分组织团块已通过裂解盘进入上层剪切室；如有必要，将离心管重新放回剪切仪支架中继续剪切。剪切完成后，将剪切室从支架装置中取出，并使用管子工具卸下剪切帽，将其放置于洁净表面以备后续使用——建议仅在同一份样品操作中重复使用，以避免来自其他组织样品的交叉污染。将剪切后的心脏组织转移至第三个烧杯中，烧杯内含40毫升洗涤缓冲液和一个搅拌子，将烧杯置于搅拌台上，以中等速度搅拌组织5分钟。

将悬浮液通过预先润湿的尼龙单丝网筛进行过滤。弃去滤液后，用10毫升洗涤缓冲液在滤器上清洗切碎的组织三次。将清洗后的组织转移至一个50毫升烧杯中，加入20毫升洗涤缓冲液，并将烧杯置于磁力搅拌器的冰浴中。

在持续搅拌的条件下加入 0.5 毫升胰蛋白酶溶液，搅拌 15 分钟。搅拌进行至大约一半时，将组织悬液转移至一个可容纳 15 毫升体积、研磨配合较松的手持式玻璃匀浆器中。用 4 到 5 次轻柔的上下研磨动作匀浆悬液，避免产生泡沫。

然后，将匀浆液放入50毫升烧杯中，在搅拌板上混合。接着，向匀浆液中加入10毫升含有胰蛋白酶抑制剂的分离缓冲液，边轻轻搅拌边孵育。再次通过尼龙滤膜过滤悬液后，将滤膜保存在50毫升锥形管中，并将留在滤膜上的颗粒部分转移至玻璃匀浆器中。

加入15至20毫升洗涤缓冲液，用手轻轻匀浆25至30秒。将匀浆液与滤液合并后平衡离心管，离心，然后用塑料移液器吸走上清液，保留距离疏松沉淀顶部0.2毫升的液体。将所得上清液通过尼龙滤器过滤至新的锥形管中，以避免污染，并再次离心一次。

弃去上清液后，通过向管壁侧面加入分离缓冲液来重悬沉淀，洗涤2至3次，以防止沉淀破碎或污染。每次均弃去松散的白色外层。向每根试管中加入5毫升分离缓冲液，使用带1毫升枪头的移液器或新的转移移液器将沉淀吹打分散。然后用额外的20毫升分离缓冲液稀释悬液，并在4°C条件下以8,500 × g离心15分钟。

弃去上清液后，先将沉淀重悬于5毫升重悬缓冲液中，再加入15毫升重悬缓冲液，于4°C、8,500 × g离心15分钟。弃去上清液，保留含有洗涤后完整线粒体的棕色沉淀。将富含线粒体的沉淀重悬于250微升含有蛋白酶抑制剂的重悬缓冲液中。

将悬浮液以25 µL体积分装，液氮中快速冷冻，然后在-80 °C超低温冰箱中可保存数年。按照本方案，从两组母猪所产仔猪的心脏组织中制备了线粒体富集蛋白，其中一组母猪在妊娠期间进行运动，另一组则保持静息状态。

电子传递链（ETC）蛋白谱分析显示，运动母猪后代的某些ETC复合物水平相对降低。线粒体蛋白在3%至8%的梯度BN-PAGE中分离，并使用抗体混合物进行免疫印迹检测。运动组与久坐组均表现出多种超复合物。

在运动组中观察到的显著超复合体增加出现在九个月时，相较于久坐组。从48小时、三个月、六个月和九个月不同年龄组获取的线粒体富集蛋白，通过动力学检测法分析了复合物I-II的活性。运动组的复合物I-II活性高于久坐组。

其他研究者已证明，对从冷冻组织和细胞中获得的线粒体进行功能研究是可行的。从冷冻组织中制备线粒体的方法可广泛适用于多种组织，且造成的损伤极小。