DiI 灌注作为墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）血管可视化的一种方法

本实验的总体目标是可视化墨西哥钝口螈的血管系统。该方法有助于回答再生医学领域中的关键问题，即墨西哥钝口螈再生组织再血管化的复杂过程。这种血管可视化技术的主要优势在于，可在标准荧光显微镜下轻松成像动物体内的全部血管。

尽管该方法可用于研究墨西哥钝口螈肢体的再生，也可应用于其他组织，如尾部、心脏、眼睛、鳃或其他器官。在打开墨西哥钝口螈胸腔前，应先通过脚趾夹捏法确认其已达到适当的麻醉深度。然后，使用手术镊在肩线稍下方沿胸腔中轴线夹捏皮肤。

使用手术刀在皮肤被提起处做一切口，切除胸部的一块方形皮肤，以暴露两块软骨板。接着，在胸腔上方打开一个窗口，小心撕开结缔组织，避免切断任何主要血管。用镊子逐个提起每一块软骨板，并用手术剪将其切除。

用镊子小心夹住暴露的心包膜。将组织轻轻提起，用手术剪刀刺穿心包膜，深度以刚好能去除心包膜而不损伤心脏为宜。随后，轻柔地移除心包膜，以暴露心脏和主动脉，从而清晰观察从心脏分出的大约五毫米处的主动脉及心脏本身。

为了灌注墨西哥钝口螈，将装有蝶形针头的铁架台放置在聚苯乙烯泡沫支架旁边，使铁架的臂部便于操作以插入针头。打开蠕动泵，使0.7x PBS缓冲液流经泵管，并将针头尖端朝向前脑方向。将镊子滑至主动脉弓下方，轻轻向上提起。

然后，移动针头与夹子的组合，使针头沿主动脉长度方向朝向动物头部，并将针头插入主动脉约五毫米，同时用镊子在主动脉后方提供支撑。成功插入可通过观察到心脏心房明显扩张来确认。迅速刺破一个心房，使血液流出。

然后，用约 20 至 30 毫升 PBS 灌注蝾螈。成功灌注后，动物体色应由浅粉色变为白色。当所有 PBS 均已完成灌注后，暂停蠕动泵，并将管路的游离端移入含有 15 毫升稀释液（Dil solution）的离心管中。

重新启动泵，注意避免在管路中产生气泡，并用全部工作浓度的Dil储备液灌注动物。在成功的灌注过程中，墨西哥钝口螈的身体将变为鲜粉色，这一变化在鳃部最为明显。当所有Dil溶液完成灌注后，暂停泵的运行，并将管路的游离端放入4%多聚甲醛溶液中。

然后，重新启动泵，灌注至少10毫升固定液。当所有多聚甲醛注射完毕后，停止泵运行并移除针头。将墨西哥钝口螈转移至塑料培养皿中，并将培养皿放置于荧光显微镜载物台上。

然后，在关闭光源的情况下，选择一个允许 Dil 激发的滤光片，Dil 可发出红橙色光。成功灌注后，Dil 染料在所有墨西哥钝口螈组织中均可见，表现为红色的标记信号，包括尾部、四肢、鳃和眼睛。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一小时内完成。

在进行该操作时，需注意在打开胸腔时避免损伤主要血管或心脏，并应沿主动脉方向插入针头，以防止贯穿性穿刺。完成该操作后，可进一步采用其他方法（如骨骼制备）来回答更多科学问题。该技术建立后，为生物医学领域的研究人员探索不同物种的血管系统奠定了基础。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用碳菁染料Dil对墨西哥钝口螈进行心脏灌注。请务必注意，操作针头和多聚甲醛时可能存在极高危险性，因此在进行实验操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴适当个人防护装备。