一种适用于大量样本实验中表征土壤微生物的脂质提取与分析方法

本视频的目的是介绍一种方法，该方法在提取微生物细胞膜脂质时，能够在提高通量的同时平衡工作量与准确性，适用于表征总脂质以及指示性脂质的相对丰度，以确定土壤微生物群落结构，并适用于包含大量样本的研究。在野外采样时，应考虑土壤的空间异质性，采用能够代表采样地点特征的方式采集土壤样品。为保持采样时刻的微生物群落状态，样品从野外采集后应置于冰上运输。

返回实验室后，去除根系和石块，并通过粗筛破碎土块。此步骤也有助于样品的均质化。将样品分装至适当的容器中，尽快进行冷冻干燥处理。

土壤冻干后，应储存于含干燥剂的密封容器中，直至进行提取。冻干土壤最好在 -80 °C 下保存。提取前，将冻干土壤从储存容器中取出并研磨。研磨方法包括球磨机、振荡磨或研钵与研杵。

再次研磨土壤后，充分均质化土壤样品，并储存于冰箱中。所有实验器具必须彻底清洁。任何残留的洗涤剂、油脂或污垢都可能在最终的气相色谱图中产生峰，从而影响实验结果。

提取操作在30毫升聚四氟乙烯（Teflon）离心管中进行，离心管必须用溶剂冲洗。向管中加入2至3毫升己烷，涡旋数秒。将己烷倾入另一管中并涡旋。

可使用2至3毫升正己烷依次冲洗六个试管。将经正己烷冲洗后的试管倒置存放于通风橱中，并将使用过的正己烷弃置于适当的废液容器中。玻璃器皿可在使用前进行灼烧处理或用溶剂冲洗。

灼烧可确保通过高温氧化残留物来清洁玻璃器皿。将玻璃器皿用两到三层铝箔包裹后放入马弗炉中。设定温度为450摄氏度，待炉温达到设定值后，至少烘烤4.5小时。

从炉中取出前，至少冷却一小时。标记并称量经正己烷冲洗过的聚四氟乙烯管。将土壤加入聚四氟乙烯离心管中，并重新称重以确定土壤质量。

每次处理批次时至少制备两个空白样，并加入一个检核标准品，最好选用一种先前已提取过的土壤，以验证提取过程是否正确完成。脂质提取：为磷酸盐缓冲液、氯仿和甲醇分别准备三支5至10毫升的重复移液管。

氯仿是一种密度很高的液体，具有较低的表面张力。请小心确保所分配的液体量准确且一致。保持瓶内液体至少半满。

在通风橱中，按照以下顺序将试剂加入特氟龙管中的土壤样品：磷酸盐缓冲液、氯仿和甲醇。这是从样品材料中进行的第一次脂质物理提取。试剂溶液的配制方法详见书面实验方案。

溶剂的比例及添加顺序对于有机相与水相的正确分离至关重要。在加入缓冲液后，应让土壤充分润湿，再加入氯仿。若操作方便，可将提取剂合并，在第二次及后续任何提取步骤中作为单次等分量加入。

将聚四氟乙烯（Teflon）管盖紧，并遮盖以避光。将它们水平放置在摇床中，确保固定牢固。调至高速，振荡 1 小时。

在振荡离心管的同时，为每个样品准备两支长玻璃管，步骤如下：标记试管，加入与土壤中等体积的氯仿以及等体积的磷酸缓冲液。在25 °C振荡结束后，将聚四氟乙烯（Teflon）离心管从摇床中取出，于2,500 ×g离心10分钟。

然后，在通风橱内关闭光源，将特氟龙管中的上清液倾入其中一根长管中。在玻璃管中应可见相分离现象，下层为有机溶剂（主要为氯仿）及脂质。

重复此提取步骤。将上清液倒入之前准备好的第二个离心管中。此时，您已对土壤中的脂质进行了两次物理提取。

对于大多数土壤而言，此步骤已足够。使用带聚四氟乙烯衬垫的盖子牢固密封所有长型试管，倒置10次以混匀。通过重力作用静置过夜，使各相分离。

将样品静置过夜，以完成两相的分离。操作时，将样品置于避光的柜子中，或用铝箔包裹后于室温下存放。允许提取物在周末期间进行分离亦可。

第二天，脂质的提取。在第二天，吸除水层，并通过真空蒸发系统去除溶剂来浓缩脂质。样品也可置于水浴或沙浴中，并通入温和的氮气流进行干燥。

此时，管中的液体应已充分分离且大部分澄清。如果尚未达到此状态，或两层之间的界面特别厚，则应继续静置一天。在通风橱中设置真空抽滤装置。

这是一个侧臂烧瓶，通过一段莱叶泰龙管与真空泵相连，并接入一根巴斯德移液管。开启泵后，使用该移液管将水相抽入烧瓶中。吸取上层液体及界面层。

这大约位于下方三分之二处。对两到三组玻璃管进行此操作。上层可能含有少量土壤颗粒。

尽可能移除这些。通过小心倾倒，将第二组和/或第三组试管中的提取物合并到前两支试管中。倾倒时尽量避免倒入任何固体物质，并通过旋转冲洗试管内壁。

每个样品使用一支干净的移液管，并对剩余样品重复此过程。待氯仿提取液合并并静置数分钟后，检查液体表面。通常会形成一层薄薄的残留水层。

如果存在此情况，应在继续操作前进行抽吸。残留的水分可能会攻击脂肪酸的双键，但少量水分应在样品干燥过程中随溶剂共蒸发。使用真空蒸发装置将所有样品干燥。

将管子盖紧，并在 -80 °C 的冷冻器中保存。第三天，进行皂化和甲基化。首先，打开水浴锅，检查水位，并将水浴锅一设定为 95 °C，水浴锅二设定为 80 °C。使用多通道移液器，向干燥的脂质中加入 1 mL 皂化试剂（试剂 1）。

盖紧盖子，短暂涡旋，然后放入试管架中。完成此步骤后，将装有试管的试管架置于95 °C水浴中，静置5分钟。从水浴中取出试管架，检查试管是否有泄漏。

这将表现为管内有气泡上升，形成泡沫状。重新拧紧或更换漏液管的管盖。继续将管子在水浴中加热10分钟。

将水浴锅的温度设置降低至80摄氏度，继续孵育15分钟。取出试管架，将其放入盛有自来水的容器中冷却。切勿使用冰水。

待样品冷却后，向每个样品中加入2毫升甲基化试剂（试剂2）。再次盖紧盖子，涡旋振荡5至10秒。溶液中可能出现颗粒状盐类沉淀，这是由于试剂过量所致，属正常现象。

将试管架放入80 °C水浴中，孵育10分钟。从水浴中取出试管架，放入盛有自来水的容器中冷却。振荡试管架以加快冷却过程。

使用多通道移液器，向每根试管中加入1.25毫升正己烷和甲基叔丁基醚（试剂3），以进行相萃取。盖紧管盖，将试管置于摇床中振荡10分钟。振荡结束后，将试管架静置10分钟，使两相充分分离。

使用巴斯德吸管将有机相（现为上层）转移至短玻璃管中。应尽量回收大部分液体，残留少量水相不会影响提取效果。

通过加入试剂3，振荡，静置分层，然后转移上层相，重复水相提取。根据下层相的状态，可再重复此步骤一次，共进行三次转移。向短管中的提取物中加入3毫升碱洗液（试剂4），即氢氧化钠的稀溶液。

将试管盖紧，涡旋振荡20至30秒，然后在2,000 RPM条件下离心3分钟。离心后，使用洁净的巴斯德吸管小心吸取上层有机相，并转移至4毫升棕色样品瓶中。注意切勿吸入任何水相成分。

下一步是在真空蒸发装置中将溶剂完全蒸发至干燥。第四天，准备用于气相色谱分析的提取物。使用移液器，向每个含有干燥相的4毫升小瓶中加入100微升试剂3。

涡旋混匀样品，然后静置10分钟。使用第二个移液器，小心地将悬浮的脂肪酸甲酯（FAMEs）转移至气相色谱（GC）小瓶中。向4毫升小瓶中加入另一份溶剂，并短暂涡旋混匀。

轻轻滚动离心管，确保管壁上残留的脂肪酸甲酯（FAMEs）完全溶解。再次使用第二个移液器，将溶剂转移至气相色谱（GC）样品瓶中。再加入第三份等份的溶剂至离心管中，涡旋混匀，然后将溶液完全转移至GC样品瓶中，以完成全部转移过程。

盖紧气相色谱小瓶，并存放在冰箱中。在分析前，将密封的气相色谱小瓶置于冰箱中保存。气相色谱分析。

使用该系统时，必须采用特定的气相色谱柱进行分析。气相色谱仪配备分流/不分流进样口，内置内径为4毫米的玻璃衬管，并装有带去活化玻璃棉插件的衬管。进样口温度设定为250摄氏度，并以恒定压力模式运行。

载气为氢气。检测器辅助气体需要氮气和空气。使用安捷伦Ultra 2色谱柱。

色谱柱长度为25米，内径为2毫米，固定相液膜厚度为33微米。该色谱柱的固定相为5%苯基-95%甲基聚硅氧烷，也称为DB-5型色谱柱。分析脂质提取物时，将2微升等分试样以100:1的分流比进样，进样时烘箱温度为170°C。进样后，程序设定烘箱温度以每分钟5°C的速率升至300°C，然后保持12分钟。

按照MIDI手册中的说明，进行一系列MIDI标准品的进样，所得结果用于相应调整。通过此方式校准后，系统可能偶尔需要进行微调，但通常情况下使用这些参数即可获得良好结果。MIDI系统会为每个样本生成一份报告，报告中包含一个表格，每行对应一个实际检测到的峰。

该软件会报告峰保留时间、峰面积、峰鉴定结果，以及ECL（估计链长度）或用于峰鉴定的参数，还有响应因子，即用于校正保留时间相关的检测器响应差异和变异性的参数。ECL表示每个未知FAME在一系列直链FAME中的洗脱位置。例如，如果某个未知物的保留时间介于12碳链和13碳链FAME之间的一半位置，则其ECL将报告为12.5碳链。

该软件将每个峰的ECL值与数据库中FAME的ECL值进行比较，当出现匹配时，便为未知物分配相应的名称。对于数据库中ECL值非常接近的两种FAME，软件会同时列出两个名称，并将最接近的排在首位。报告中的数据表可汇总至电子表格或数据库中。

在对响应因子进行校正后，可将峰面积与外标或内标的峰面积进行比较，从而计算出提取物的浓度。通过除以提取土壤的质量，数据可表示为每克土壤中脂肪酸甲酯（FAME）的质量，或者结合各脂肪酸甲酯的分子量，表示为每克土壤中脂肪酸甲酯的纳摩尔数。随后可将生物标志物脂肪酸甲酯加和，以获得微生物功能群的生物量，并可对这些功能群作进一步分析。

例如，此处我们观察到未施肥的草原比施肥的草原具有更高的FAME生物量。两者均比邻近玉米田的生物量更高。此外，FAME与特定的功能类群（如真菌或细菌）相关联。

这些关联关系具有生态系统特异性，因此不应过度泛化。此类分析可用于判断某些类群在特定环境中是否更为丰富。此处显示，与玉米田相比，真菌在未施肥的草原中更为丰富。

最后，另一种观察整体微生物群落组成的方法是利用非度量多维尺度分析（NMDS）或主成分分析（PCA）等排序方法，同时比较所有脂肪酸甲酯（FAME）的相对丰度。在排序图中，相似性较高的微生物群落会彼此靠近。因此，根据我们的示例数据，玉米样地与未施肥草原样地相距很远，而部分施肥草原样品的微生物群落与玉米样地相似，另一些则与未施肥草原样地相似。

微生物群落即使在同一种环境中也常常表现出高度变异性，因此它们并不总能被清晰地分离。观看本视频后，读者应能充分理解如何从土壤中提取微生物细胞膜中的脂质生物标志物。磷脂脂肪酸的提取是一种有效、快速且经济的方法，可通过鉴定独特的微生物生物标志物来评估微生物功能群及总微生物生物量。