用于土壤样本多组学分析的 MPLEx 方案

该方法通过帮助获取与土壤相关的微生物群落在环境扰动下发生的分子变化的全面信息，被广泛应用于蛋白质组学、代谢组学和脂质组学领域。该技术的主要优势在于，从单个土壤样品中同时获取多种分析物，可提高检测的精确性和准确性，同时减少样品制备所需的时间和工作量。开始操作时，针对每个20克的土壤样品，分别称取10克至两个可耐受甲醇/氯仿的50毫升离心管中。

使用聚四氟乙烯（PTFE）制成的塑料管，因为氯仿会浸出大多数塑料，从而污染样品。向每根管中加入约10毫升经氯仿清洗过的不锈钢珠和石榴石珠。然后在冰上操作，向每根管中加入4毫升冰冷的超纯水，并将装有样品的管子置于冰桶中，转移至通风橱内。

使用25毫升玻璃刻度移液管，迅速向各管中加入20毫升预冷的氯仿-甲醇（2:1，体积比）溶液。盖紧管盖，涡旋振荡使土壤混合物充分溶解。氯仿-甲醇溶液有助于破坏原核生物的细胞壁，并能抑制酶活性。

接下来，将离心管连接到50毫升离心管涡旋振荡装置上，如果可能，置于冰箱内4°C条件下水平涡旋振荡10分钟。然后，将样品放入-80°C超低温冰箱中约15分钟，以使其充分冷却。随后，在通风橱内使用探头式超声破碎仪，用直径6毫米（1/4英寸）探头在冰上以60%的振幅对每个样品超声处理30秒。

超声处理后，应将样品置于 -80 摄氏度的低温冰箱中，因为超声过程会产生大量热量。重复水平涡旋、超声和冷冻步骤后，在 4 摄氏度条件下以 4,000 ×g 离心 5 分钟。此时，样品将分为上层的代谢物层、中间的蛋白质层和下层的脂质层。

将样品置于冰上。然后在通风橱内，使用10毫升玻璃刻度移液管，将两个50毫升离心管中的上层代谢物层转移至一个大的玻璃样品瓶中。接着，轻轻倾斜50毫升离心管，使中间的蛋白层释放，使其自由漂浮于下层脂质层之上。

然后，使用一把洁净的不锈钢平头实验铲，小心地将两层蛋白质中间层一起刮出，并转移至一个新的50毫升离心管中。使用一支25毫升玻璃刻度移液管，将下层的脂质层转移至一个大的玻璃瓶中。向含有残渣的两个离心管以及含有蛋白质中间层的一个离心管中各加入20毫升预冷的甲醇。

短暂涡旋混匀各管，然后在4,000 × g、4 °C条件下离心5分钟，以收集沉淀物和蛋白质中间层。随后，在通风橱内将甲醇上清液倾倒至有害废物容器中。用液氮冷冻蛋白质和沉淀物，再在冻干机中干燥约2小时。

向每个碎片沉淀中加入20毫升蛋白质溶解缓冲液（50毫摩尔Tris缓冲液，pH 8.0），向蛋白质中间层管中加入10毫升。在通风橱中，将样品以20%的振幅进行探头超声处理30秒，使其溶解。将样品涡旋振荡两分钟。

然后，将蛋白质中间层样品放入50摄氏度的实验室管式旋转仪中旋转30分钟，以溶解蛋白质。将残渣样品水平涡旋额外10分钟，以裂解任何残留的完整细胞。接着，将蛋白质中间层样品继续旋转剩余的20分钟。

将所有样品在室温下以4,500 × g离心10分钟，每份样品收集上清液至两个50毫升离心管中。向蛋白质中间层沉淀中加入10毫升溶解缓冲液，随后进行超声处理，并涡旋振荡使沉淀重新溶解。

离心后，将上清液等量合并至两个含有碎片沉淀上清液的50毫升离心管中，在4°C条件下，使用固定角转子以8,000 × g离心10分钟，以沉淀任何残留的碎片。将上清液分装至两个50毫升离心管中。然后，使用10毫升玻璃刻度移液管，向每根离心管中加入7.5毫升三氯乙酸（TCA）。

将样品涡旋振荡至溶解。随后，将样品置于负20摄氏度冰箱中冷冻2小时至过夜。为沉淀蛋白质，于4摄氏度条件下以4,500 × g离心10分钟，收集沉淀，并将上清液倾入废液容器中。

向每份蛋白质沉淀中加入10毫升100%预冷的丙酮。涡旋振荡各管，将相同的沉淀合并至同一管中。离心后小心倾去丙酮。

使用较少量的丙酮洗涤沉淀物两次，并将悬液转移至1.5或2毫升离心管中进行最终离心。将上清液倒入废液容器中，然后将沉淀物倒置在通风橱内的纸巾上干燥约20分钟。根据沉淀物的大小，加入100至200微升蛋白溶解缓冲液。

将沉淀物超声并涡旋至溶解。注意，由于腐殖物质随蛋白质一同沉淀，样品可能呈黏稠状，后续离心步骤将去除这些物质。最后，在300 rpm、40摄氏度条件下于摇床或培养箱中振荡样品30分钟，使蛋白质充分溶解，随后即可进行蛋白质消化或速冻保存以备后续处理。

通过本视频展示的MPLEx方案，从堪萨斯州本土草原土壤中提取出3,376种肽段、105种脂质和102种极性代谢物，并通过反相液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）将该方案的蛋白质提取效果与市售蛋白质提取试剂盒及SDS提取法进行了比较。在初步比较市售蛋白质提取试剂盒和SDS方法的三个重复样本时，两种技术之间仅有12%的肽段重叠，表明微生物群落的复杂性以及不同提取方法带来的差异。将MPLEx方法与市售蛋白质提取试剂盒及SDS提取物进行比较时，使用MPLEx方法检测到的肽段中约有38%在SDS和/或市售试剂盒提取中也被检测到。

考虑到堪萨斯州土壤细菌群落及其宏基因组中的物种数量，肽段鉴定结果的重叠是合理的。如前所示，MPLEx 方法的广泛适用性已通过多种样本进行了评估，包括古菌 S.acidocaldarius、单细胞蓝藻群落、小鼠脑皮层组织、人尿液以及 A.thaliana 叶片。在所有情况下，MPLEx 方法检测到的蛋白质数量与对照组相似，表明该方法适用于多种不同类型的样本。

观看本视频后，您应能够充分了解如何从单个土壤样品中提取蛋白质、代谢物和脂质。在进行该实验操作时，需保持灵活性，因为不同类型的土壤存在差异。例如，蛋白质中间层的大小将因土壤中的生物量及腐殖质成分的不同而有所变化。

请注意，使用氯仿可能具有极高危险性，进行本实验操作时，务必采取预防措施，例如在通风橱中操作。