ODELAY：一种用于酵母生长多参数定量分析的大规模方法

ODELAY 的总体目标是以高通量方式测量单个细胞在形成菌落过程中的生长表型。该方法有助于回答微生物学、遗传学和系统生物学中的关键科学问题，例如遗传扰动和药物相互作用对任何可形成菌落的微生物生长表型的影响。ODELAY 的主要优势在于，它使研究人员能够直接观察并量化大量个体之间的群体异质性。

在组装琼脂模具之前，使用70%乙醇清洁亚克力模具，并用强制气流干燥。模具包含三个底部部件和两个直立部件。开始组装琼脂模具时，取三个底部部件，将两个相同的部件夹住第三个部件，形成三明治结构。

使用两个小型文件夹夹子将基座部件从两侧夹紧。将直立部件放入模具中，并确保激光切割的弧线位置正确。将一块清洁并干燥的载玻片放置在模具上，并固定其位置，同时将另一块载玻片放置在另一侧。

用较大的长尾夹固定组件。用较大的长尾夹将两张载玻片夹紧，确保每个上方的长尾夹均与玻璃载玻片接触并覆盖丙烯酸板边缘。在向组装好的模具中注入熔融琼脂前，沿模具内侧边缘加入约70微升熔融琼脂培养基，以密封模具缝隙。

通过将熔化的琼脂沿模具边缘缓慢移液，以避免在内部截留气泡。模具注满后，在约23摄氏度的环境温度下冷却40至60分钟。下一步是脱模。

首先取下底部的文件夹夹子，然后移除由三片夹心结构组成的模具底部。用手捏住载玻片并保持压缩状态，再小心地取下文件夹夹子。

将模具放置在实验台边缘，使带有蓝色圆点的一侧朝上。将两个拇指置于亚克力板下方，食指放在模具顶部内侧边缘处，缓慢而小心地用拇指向上推动模具，如同以模具下边缘为支点将其翻转。施加持续但逐渐增大的压力。

在顶部玻璃覆盖模具垫片的边缘处，应出现一条裂纹和一个气泡。观察到初始裂纹线后，继续用两个拇指向上推，并施加持续压力。琼脂应开始从玻璃上分离。

继续将模具向上翻转。当玻璃完全脱离后，将其抓住并彻底从模具中取出。然后用类似的动作移除另一块模具，将该部件抬起脱离，同时避免移动琼脂。

将载玻片放入一个无菌的盒中，盒底加入一些无菌高纯度水。盖上盒盖，于4摄氏度下过夜保存，次日使用。按照文本方案中的描述，在96孔板中准备菌株，以开始此操作。

使用酶标仪测定每种培养物在600纳米处的光密度。接下来，使用自动稀释程序将微孔板中的培养物稀释至600纳米处的光密度约为0.1。设置好稀释程序后，按照甲板布局图所示，将微孔板、离心管和吸头装载到液体处理机器人的甲板上。

单击播放按钮以运行稀释程序。选择正确数量的 50 微升吸头和正确数量的 300 微升吸头。稀释完成后，将稀释板从机器人中取出，并在 30 摄氏度下培养平板，保持湿度以防止平板干燥，培养时间为五到六小时。

在培养板孵育完成前约一至两小时，开启显微镜的孵育腔，并使其在30摄氏度下平衡。使用相同的自动稀释程序，将培养物再次稀释至600纳米处的光密度值为0.01至0.02。用金属冷冻封膜覆盖稀释板，并将该板漂浮于冰水浴中，超声处理30秒。

将四个96孔平底板标记为一、二、三和四。按照以下模式，将稀释板中每份超声处理后的培养物各150微升转移至平底板中：将A1至D6孔中的样品转移至一号板的C4至F9孔。

将A7至D12孔加入第二板的C4至F9孔中。将E1至H6孔加入第三板的C4至F9孔中。将E7至H12孔加入第四板的C4至F9孔中。

开始此操作时，将琼脂糖载玻片正确放入载玻片室中。接着，按照象限顺序将96孔平底板从左至右依次放置于桌面上，分别为第一、第二、第三和第四块板。

将吸头放入四个空的吸头盒中，使每个吸头盒内侧的24个孔位均放置吸头。在第五个吸头盒中，于C10位置放置一个完整的吸头，并在A1、A12、H1和H12位置放置末端被剪去的吸头。这四个剪去末端的吸头将为吸头板夹提供稳定性。

将第一个打孔针放入机器人控制点样程序的起始位置，在琼脂糖上打孔，该孔稍后用于对齐原点坐标。将一号板放置于液体处理机器人上，用于点样第一象限。移去盖子，继续执行点样程序。

检查以确保所有点样均存在。将使用过的吸头排入生物危害容器中，并在机器人上安装新的吸头。等待约30秒，使点样干燥至直径约一毫米，然后继续运行程序。

将一号板更换为二号板，并继续点样程序。当四个象限均完成点样且点样点干燥后，盖上玻片室盖子，并将装置翻转过来。在玻片室的顶部放置一片玻璃载玻片。

首先将载玻片室装入显微镜。通过运行自定义设计的脚本进行时间序列显微成像。单击快门按钮以打开透射光快门，然后单击聚焦按钮以启动高帧率相机采集。

单击“Go Origin”，移动载物台以找到在琼脂中 punched 出的原点标记，然后向右轻微移动，聚焦于 E7 区域点样的细胞。返回原点 punch 位置，并将其置于视野中央。通过按下“Set”按钮将原点设置为该位置。移动至 H18 位置，并使用靠近该位置的六角螺钉进行聚焦。

然后移动到位置 L7，并使用距离该位置最近的六角螺钉进行聚焦。最后移动到位置 E7，并使用距离该位置最近的六角螺钉进行聚焦。在中心以及 E12、H12 和 L12 位置的边缘检查焦点，如果焦点的 z 值超出自动对焦范围的正负范围，则调整自动对焦范围。

按下“重置”按钮，然后按下 ODELAY。选择用于保存数据的目录。显微镜将连续采集数据 48 小时，或直至程序关闭。

这些代表性延时图像显示了酵母细胞在固体培养基上点样后0小时、3小时、6小时和9小时的生长情况。图中展示了一组代表性数据集，用于比较两种酵母菌株在延时图像处理后的生长差异。相对一致的倍增时间反映了制备良好的琼脂糖载玻片，但滞后期存在较大差异，这是由于自动对焦设置未达到最佳状态所致。

此处展示的数据集更加一致，所有倍增时间均表现出良好的重叠，且滞后期也较为一致。一旦掌握，若操作得当，ODELAY 的设置可在三到四小时内完成。要获得可重复的 ODELAY 测量结果，最关键的步骤是始终如一地制备培养基，并在分离载玻片时避免对培养基造成机械形变。

ODELAY 是一种非常灵敏的检测方法。例如，它能够在室温下观察到温度敏感型酵母菌株的生长缺陷，而常用的基于点种的检测方法则需要在 37 摄氏度下培养酵母才能揭示生长缺陷。尽管 ODELAY 是在酵母中开发的，但该方法适用于任何能够形成菌落的生物体，包括病原体，可用于探索广泛的环境和遗传条件，以理解微生物的行为。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何执行 ODELAY 实验，以测量在固体培养基上形成菌落的单细胞微生物的生长表型。请务必注意，操作微生物可能存在生物安全风险，因此应始终采取预防措施，例如穿戴适合所研究微生物的个人防护装备。