利用CRISPR串联体在小鼠小肠类器官中进行多基因敲除的实验方案

本实验方案的总体目标是将多个向导RNA克隆至一个CRISPR串联载体中，并在小鼠肠道类器官中实现高效的电穿孔转染，从而实现多个基因的同时敲除。该方法可通过克服潜在的平行代偿效应，显著提高功能缺失研究的效率。我们所采用的CRISPR串联策略的主要优势在于仅需一步克隆操作，操作简便，并可实现最多四个不同基因的同时敲除。

本实验操作将由我实验室的博士生Alessandra Merenda进行演示。将引导RNA（gRNA）克隆至CRISPR串联体载体的过程，首先需进行一个反应，使每条gRNA寡核苷酸的上链与下链退火，并对其末端进行磷酸化。在冰上配制反应体系：针对三个串联体，加入3微升gRNA上链、3微升gRNA下链、2微升T4 DNA连接酶缓冲液、1微升T4多核苷酸激酶，再加水至总体积为20微升。

使用移液器充分混匀，并按照以下条件运行热循环仪：37摄氏度反应30分钟，95摄氏度反应5分钟，以每分钟0.3摄氏度的速率降温至25摄氏度，然后在4摄氏度保存。下一步为Bbs1洗脱反应，在该反应中将预先退火的gRNA寡核苷酸插入至串联体载体的相应位置。用无DNA、RNA酶的水将反应混合物按1:100稀释，以生成含三个和四个gRNA的串联体载体。

在冰上配制 Bbs1 双酶切连接反应体系。每反应体系中加入 100 纳克 CRISPR-串联载体、10 微升寡核苷酸混合物、1 微升限制性内切酶缓冲液、1 微升 DTT、1 微升 ATP、1 微升 Bbs1 酶、1 微升 T7 连接酶，加水至总体积为 20 微升。用移液器充分混匀，并设置包含载体的阴性对照。

在PCR仪中进行反应，使用以下程序：用于克隆三个和四个gRNA串联体时，进行50个循环，每个循环为37°C下5分钟和21°C下5分钟，随后在37°C下保持15分钟，然后在4°C下长期保存。对于两个gRNA串联体，采用相同的设置，但第一步循环数为25个。BbsI片段重排反应完成后，取每个连接反应混合物11 µL，加入1.5 µL外切酶缓冲液、1.5 µL ATP、1 µL DNA外切酶以及水，补至总体积为15 µL。

在37°C孵育30分钟，随后在70°C孵育30分钟。接着，按照标准方案，将反应混合物用于转化化学感受态E. coli细菌。为确认CRISPR串联体载体中存在gRNA插入片段，使用接种环挑取细菌菌落，并将每个菌落接种于4 mL LB培养基中。

将克隆物在37摄氏度的摇床中过夜培养。次日，按照生产商说明书，使用质粒小提试剂盒提取DNA。在10微升反应体系中，将每份DNA样本约200纳克与10单位EcoR1和5单位BglII混合。

设置一个单独的反应体系，加入相应的原始载体作为阳性对照，用于大小比较。将反应体系在37摄氏度孵育3小时。在1%琼脂糖凝胶上以90伏电压电泳约20分钟，进行酶切反应产物的检测。

使用紫外透射仪观察凝胶，以鉴定含有正确插入片段大小的克隆。为确认gRNA已克隆至正确位置，从而所有Bbs1识别位点均已丢失，用5单位的Bbs1酶切所选克隆。同时设置一个独立的反应体系，以相应的原始载体作为对照。

在 37 摄氏度孵育 3 小时，将消化反应产物在 1% 琼脂糖凝胶中以 90 伏电泳约 20 分钟。使用紫外透射仪观察凝胶，鉴定未被 Bbs1 切割的载体。进行电穿孔传代时，每次转染至少接种一个 48 孔板中的六个孔。

将类器官接种于20 µL基底膜基质液滴中，每孔加入250 µL含烟酰胺的WENR培养基，在37°C、5% CO₂的湿润培养箱中培养。第2天，弃去含烟酰胺的WENR培养基，每孔更换为250 µL不含抗生素的EGF、noggin、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂培养基。第3天，将类器官培养基更换为不含抗生素的EGF、noggin、GSK3抑制剂、ROCK抑制剂及1.25%二甲基亚砜（DMSO）培养基。

第4天，使用1毫升移液枪头破坏基底膜基质小滴，将类器官转移至1.5毫升离心管中。将48孔板中四个孔的培养物收集至同一根离心管中。使用P200移液枪反复吹打约200次，将类器官机械性地剪切为小片段。

在室温下以600 × g离心五分钟。离心后，弃去所有试管中的上清液，并将沉淀物重悬于一毫升细胞培养级重组蛋白酶中。在37 °C下孵育，时间最长不超过五分钟。

必须仔细监测蛋白酶处理过程，因为电穿孔的成败取决于获得含有细胞簇而非单个细胞的细胞悬液。在倒置光学显微镜下使用4倍物镜观察50微升样品液滴。理想的细胞簇包含10至15个细胞，这有助于提高电穿孔后的细胞存活率。

将细胞悬液转移至低吸附的15毫升离心管中，并通过加入9毫升不含抗生素的基础培养基终止消化。在室温下以600 × g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬于1毫升低血清培养基中。

使用血细胞计数板对细胞进行计数，每次电穿孔反应至少需要 1 × 10⁵ 个细胞。开始操作时，向含有细胞悬液的 15 毫升离心管中加入 9 毫升低血清培养基，在室温下以 400 × g 离心 3 分钟。吸除所有上清液，并将细胞沉淀重悬于电穿孔溶液中。

向两个新试管中各加入总量为10微克的DNA。然后加入电穿孔溶液，使终体积达到100微升，并将细胞与DNA的混合物置于冰上。将细胞DNA混合物转移至电穿孔比色皿中，再将比色皿放入电穿孔仪的腔室。

按下电穿孔仪上的相应按钮测量阻抗，并确保其在0.030至0.055欧姆之间。根据文本方案中指示的设置进行电穿孔操作。向比色杯中加入400微升电穿孔缓冲液和rock抑制剂，然后将其中所有内容转移至一个1.5毫升离心管中。

室温孵育30分钟，使细胞恢复。30分钟后，在室温下以400 × g离心3分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于每孔20 µL基底膜基质中。

在48孔板中每孔接种约1×10⁴至1×10⁵个细胞，并加入含EGF、noggin、GSK3抑制剂、rock抑制剂和1.25%二甲基亚砜的培养基。在37°C下培养。次日，更换为含EGF、noggin、GSK3抑制剂和rock抑制剂的培养基，并通过观察GFP表达情况检测转染效率。

将类器官置于 37 摄氏度培养。两天后，更换为新鲜培养基。电穿孔四天后，将培养基更换为含烟酰胺和 ROCK 抑制剂的 WENR 培养基，并继续在 37 摄氏度下培养细胞。

通过使用 EcoR1 和 BglII 进行双酶切，确认串联体载体中存在正确数量的 gRNA 插入片段。对于含有四个 gRNA 的串联体载体，预期下条带大小约为 1.6 千碱基；对于含有三个 gRNA 的串联体载体，预期下条带大小约为 1.2 千碱基。此外，使用 Bbs1 进行酶切可确认 gRNA 已克隆至正确位置，因此所有 Bbs1 识别位点均消失。

通过电穿孔将验证后的构建体递送至小鼠肠道类器官，可实现高达70%的转导效率，GFP表达结果已证实该效率。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建gRNA串联载体，以及如何利用电穿孔技术高效地将这些载体递送至三维类器官培养体系，从而实现多个基因的同步敲除。