利用体内CRISPR/Cas9筛选技术同时评估小鼠皮肤和口腔中的基因功能

该方案具有重要意义，因为它使研究人员能够以远低于传统基因敲除小鼠模型的成本，同时探究数百个基因在头颈癌中的肿瘤抑制功能。该技术具有灵活性，可进行调整以覆盖基因表达，用于研究其在皮肤中的功能。靶向CRISPR文库方案也可应用于其他类型的癌症。

将麻醉后的动物仰卧位放置在加热的手术台上，使用手术胶带固定其足部。连接鼻式麻醉管，持续供给异氟烷和氧气，直至手术结束。为确认胚胎发育第9.5天（E9.5）的妊娠状态，取少量脱毛膏涂抹于腹部，并用棉签将其均匀涂抹至约3厘米×3厘米的区域。

两到三分钟后，用纱布或纸巾轻轻擦去药膏，并使用 PBS 和 70% 乙醇将区域擦拭干净。使用超声探头和耦合剂，检查小鼠胚胎发育情况以确定是否处于胚胎第 9.5 天（E9.5）。也可在前一天（E8.5）进行此项检查，以便节省手术当天的时间。

去除超声耦合剂，使用BPS擦拭清洁该区域，然后用70%乙醇消毒。皮下注射适量镇痛剂。随后使用无菌镊子和剪刀在皮肤上做一个垂直切口。

使用钝头镊子将切口周围的皮肤与腹膜分离。然后使用无菌镊子和剪刀剪开腹膜。用钝头镊子轻轻拉出左侧和右侧子宫角，并计数胚胎。

将大部分子宫角重新插入，但保留含有三个胚胎的子宫角远端暴露在外。使用钝头镊子，轻轻推动和拉动带有三个胚胎的子宫角，使其穿过经改造的培养皿中硅胶膜上的开口。使用油灰状黏土小块固定培养皿。

使用硅胶模具在培养皿中固定含有三个胚胎的子宫。然后用钝头工具将胚胎侧边的硅胶塞压平。向培养皿中加入无菌磷酸盐缓冲液（PBS），并用妊娠母鼠的腹部冲洗培养皿底部的硅胶膜，以防止任何泄漏。

将超声探头移入培养皿中，位于最上方胚胎上方约0.5厘米处，并调节载物台，使羊膜腔在超声图像中清晰可见。将注射针小心地对准改良后的培养皿。使用显微操作器，将针尖置于距离最上方胚胎5毫米范围内，然后前后微调针的位置，使其针尖进入超声图像中亮度最高的平面。

使用显微操作仪将针头穿过子宫壁进入羊膜腔。以缓慢的注射速度向其中注入62纳升携带sgRNA文库的慢病毒。每枚胚胎按压注射按钮8次，总计注射496纳升。

对另外两个胚胎重复相同的操作步骤。然后抬起超声探头，移除硅胶塞。使用无菌棉签轻轻将三个胚胎中的前两个推入小鼠腹腔内。

取出接下来的三个胚胎，并将之前已注射的第三个胚胎推入。重复注射步骤，直至完成所需数量胚胎的注射，注意麻醉时间不得超过30分钟。操作结束后，抬起超声探头，取下带有注射针的显微操作器，吸除PBS，移走培养皿。

使用无菌擦拭巾吸干腹腔内可能积聚的 PBS。使用可吸收缝线缝合腹膜切口。然后使用两个皮肤钉合器闭合腹部皮肤切口。

接下来，对质粒和慢病毒文库转导细胞中PCR扩增的DNA进行高通量测序，其测序读长应显示出高度相关性。如果质粒DNA中的sgRNA读长未能呈现均等的sgRNA代表，则必须仔细重复慢病毒的制备和浓缩步骤。此处展示的是在出生后第0天（P0）对E9.5 Lox-STOP-Lox confetti小鼠幼崽进行超声引导下注射携带Cre重组酶的慢病毒的结果。

虽然高滴度的病毒会导致小鼠皮肤更广泛的感染区域，但也可能导致多个sgRNA转入同一细胞中。该图显示了来自质粒和慢病毒文库转导细胞以及四个代表性肿瘤样本的PCR扩增DNA的高通量测序读数。与质粒文库或感染细胞相比，靶向肿瘤抑制基因ADAM10和RIPK4的sgRNA在肿瘤样本中显著富集。

在E9.5天进行手术至关重要。在设置交配后的第九天，需使用超声波检查小鼠是否怀孕，并确定每只雌鼠胚胎的发育时间点。幼崽出生后，可分离出被转导的细胞，并利用最新的基因分析技术（如单细胞RNA测序）对其进行深入的表征分析。