基于固体平板的饮食限制方法 秀丽隐杆线虫

该实验通过在秀丽隐杆线虫的标准培养基上实施饮食限制，以研究其对寿命、繁殖力和代谢的影响。首先精确测定用作食物来源的细菌浓度，完成该实验的第一步。实验的第二步是将细菌培养物正确稀释至适宜的浓度。

然后制备含有灭活细菌的SDR平板。最后，使用年龄同步化的线虫群体进行SDR实验。子代繁殖和寿命测量的结果可显示子代繁殖延迟且数量减少，同时平均寿命延长。

该技术相较于在 AZA 培养基中使用 Dian 等 60 种方法的主要优势在于，整个实验将在大多数温血动物实验室用于饮食限制实验的标准固体 AGA 培养基上进行，并且需针对用作食物来源的每种细菌菌株分别建立独立的校准曲线。从 LB 琼脂平板上的新鲜划线培养中挑取单个 e coli OP50 菌落，接种至 3 毫升液体 LB 培养基中，在 37 摄氏度摇床中过夜培养。对过夜培养物进行连续两倍稀释。

然后使用分光光度计在600纳米波长下测定每种稀释液的吸光度，每个样本重复测定三次。进一步将每种细菌悬液稀释一百万倍，均匀接种每种稀释液0.4毫升至100毫米LB琼脂平板上，于37°C培养18至24小时。计数每个平板上生长的细菌菌落数量，以计算每种样本每毫升的菌落形成单位（CFU/mL）。

现在将OD 600对细菌浓度作图，并进行线性回归分析，以建立测定的OD 600值与OP 50细菌浓度之间的关系。在本方法中，ad libitum饲喂条件下使用1 × 10¹¹ CFU/mL的细菌浓度，而最佳DR饲喂条件则使用1 × 10⁸ CFU/mL。然而，可能需要4至6个不同的细菌浓度以建立完整的剂量依赖关系。

针对SDR及其反应，准备接种物：取单个大肠杆菌OP 50菌落，接种于3毫升液体LB培养基中，在37°C摇床中培养6至8小时。必要时，将OP 50菌液转移至含有500毫升LB培养基的新烧瓶中，过夜培养至细菌达到饱和状态。

为测量在 OD 600 处的吸光度，配制适当的 OP 50 菌液稀释液。为确定细菌浓度，将细菌在 1500 ×g 下离心 20 分钟以收集菌体沉淀。弃去上清液，并将细菌重悬至浓度为每毫升 1 × 10¹² CFU。

现在，准备10毫升的细菌培养物，共六种不同浓度，范围从每毫升1×10¹²至1×10⁷ CFU，用移液器将0.2毫升细菌培养物加到60毫米已凝固的N GM平板中央。注意移液器枪头不要接触平板表面，因为表面的划痕会使线虫钻入琼脂内部。

将平板置于37摄氏度培养箱中孵育一小时。然后向每个平板中加入10微升浓度为100毫克/毫升的碳酸溶液和10微升浓度为50毫克/毫升的卡那霉素，以抑制细菌生长。将含有不同抗生素浓度并已杀死细菌的平板于4摄氏度保存，可供后续使用长达一个月。

准备并储存足够数量的培养基平板非常重要，最好为整个实验使用同一批次的平板。应提前至少一到两天进行预实验，以验证细菌的活性。从SDR平板上刮取少量细菌，将其涂布于含有碳酸盐、sein和抗霉素的空N GM平板上。

将培养皿置于37摄氏度培养箱中孵育6至8小时，并确认无细菌生长。对于大多数与SDR相关的研究，例如寿命分析和子代产生谱型分析，制备年龄同步化的线虫群体至关重要。使用铂金线虫挑取器将20至30只具有生殖活性的成虫转移至若干标准NGM培养皿上。

使用OP 50。根据实验所需的卵数量，可能需要更多的成虫。将培养板置于20摄氏度下4小时，以允许产卵。

将成虫从培养皿中移除，并对培养皿进行肉眼观察以检查卵的存在。继续在20摄氏度条件下培养培养皿，使后代发育至四龄晚期至成虫第一天阶段。通常情况下，N2野生型线虫在20摄氏度条件下需要三天时间完成此发育过程。

用于寿命分析。将10至12条孵化后第一天的成虫转移至SDR平板，以启动饮食限制。为获得足够的统计效力，每种SDR条件下应使用总共60至100条线虫。

每两到三天对每条线虫的存活情况进行评分，直至所有线虫死亡。重要的是，每隔一天将线虫转移至新鲜的SDR平板，以避免饥饿。该校准曲线绘制了OP50浓度与OD600之间的关系。

通过线性回归分析生成的方程可用于所有未来对OP 50细菌浓度的计算。本研究检测了慢性SDR处理对不同线虫品系平均寿命的影响，并与野生型线虫对SDR的正常剂量依赖性反应进行比较。SDR对寿命的影响在DR两个基因过表达时部分受到抑制，而DAF 16 MU 86突变对SDR诱导的寿命延长无影响。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何在海洋优雅风格的标准 AGA 演奏中进行 Dian 的操作。