使用 在体 内 研究胚胎期和围产期主动脉形态发生与发病机制的组织与细胞外植体方法

这些实验方案的总体目标是研究胚胎期和围产期主动脉壁在正常发育过程中的形成，以及在疾病状态下该过程发生的异常变化。该方法有助于解答血管发育领域的一些关键问题，例如，参与胚胎期和围产期血管中膜形成的细胞来源是什么。这些技术的主要优势在于，能够对发育的胚胎期和围产期阶段中平滑肌的发病机制及形态发生过程进行评估。

这些技术的应用意义在于治疗血管疾病，例如周期性过度产生 SUMO 细胞的瓣上主动脉狭窄症。微型泵植入手术将由耶鲁大学显微手术核心实验室的研究科学家 Jiasheng Zhang 博士进行。首先，在 2 至 6 月龄的 Cre ER 小鼠与携带 Cre 报告基因的小鼠之间建立交配组合。

使用金属探针每天早晨检查阴道栓，一旦发现阴道栓，立即将雌鼠与雄鼠分离。对于早期胚胎诱导，向妊娠期母鼠腹腔注射他莫昔芬。为了标记妊娠中期至晚期的细胞，并追踪其在出生后小鼠中的命运或克隆性，以1:2的剂量比例，将孕酮与他莫昔芬联合，不同时地注入妊娠期母鼠的腹腔内。

为了在合适的胚胎发育日期收获胚胎，先用70%乙醇清洁怀孕母鼠的腹部，然后使用剪刀切开腹部以取出子宫。用镊子和体视显微镜从子宫中收集胚胎，并小心地将其与胎盘和卵黄囊分离。将胚胎在4%多聚甲醛中于4°C固定两小时。

随后用 PBS 洗涤三次，以去除多余的固定剂。第三次洗涤后，将胚胎分别置于 15 毫升离心管中，浸入含 30% 蔗糖的 PBS 溶液，孵育至胚胎完全沉底。接着，向塑料冷冻模具中加入最佳切割温度化合物（OCT 化合物），填充至最大体积的三分之二处，并将一个胚胎垂直放入每个模具中。

室温下放置10分钟后，将组织直立置于干冰与70%乙醇混合液中冷冻，并将冷冻切片机温度设定为22摄氏度。对组织块进行切片，沿每根主动脉全长获取10至20微米厚的横截面组织切片，并在切片获得时立即用载玻片收集。所有样品采集完毕后，将载玻片在室温下干燥30分钟，然后于80摄氏度保存。

为了染色组织样本，将切片在室温下解冻，避光以防止荧光染料淬灭，并用0.1% PBS Tween 20洗涤切片。进行克隆分析时，使用适当的核染料对组织进行染色，并直接在荧光显微镜下成像彩虹Cre报告系统中的其他荧光蛋白。进行命运图谱分析时，对于mTmG Cre报告系统，可通过直接成像（无论是否进行免疫染色）观察GFP的表达情况。

为了培养和分离胚胎主动脉，将胚胎置于仰卧位，并在体视显微镜下用针固定其伸展的四肢于解剖板上。使用剪刀从腹部经胸骨向上至胸腔上部做一纵向切口。分离并去除气管、肺、食管、肝脏和肠等细微组织。

用镊子轻轻将心脏向腹侧牵拉，同时使用剪刀从胸腔和腹腔背侧分离主动脉。在主动脉近端根部和远端腹部位置剪断，以取出主动脉，并将收获的主动脉置于细胞培养超净台中无菌的冰上冷 PBS 中。短暂洗涤后，将主动脉转移至24孔板的一个孔中，孔内含有添加了0.5% PBS的DMEM培养基，然后将培养板放入细胞培养箱中孵育最多24小时。

孵育结束后，用 PBS 洗涤主动脉两次，并将组织置于 4% 多聚甲醛中固定 20 分钟。再经三次 PBS 洗涤后，将主动脉转移至含有 30% 蔗糖 PBS 溶液的 1.5 毫升离心管中，直至组织沉底。对于围产期主动脉平滑肌细胞的分离，使用 23 号针头穿刺出生后 0.5 天小鼠的左心室，并用塑料管将针头连接至装有无菌 PBS 的注射器，注射器垂直置于较高位置，使 PBS 借重力流入左心室。

当肝脏变白时，用镊子去除主动脉外的外膜组织，并按照刚刚演示的方法收获主动脉。将主动脉组织置于500 µL消化液中，每5至10分钟手动振荡一次以进行解离。45分钟后，将试管转移至无菌细胞培养操作台，使用200 µL移液器反复吹打组织悬液，直至获得单细胞悬液。

将细胞转移至15毫升锥形管中，加入2毫升DMEM，通过离心收集细胞。将沉淀重悬于3毫升平滑肌细胞培养基中，并将细胞接种至35毫米培养皿上。然后将培养皿置于37摄氏度培养箱中，每三天更换一次细胞培养基。

植入皮下渗透压微型泵时，首先使用剃毛器剃除麻醉小鼠下背部的毛发，并将小鼠俯卧位放置在加热的手术板上。用聚维酮碘和异丙醇擦拭背部消毒，然后将小鼠置于体视显微镜下。接着，使用手术刀在尾根部前方约3至5厘米处做一道0.5至1厘米长的水平皮肤切口，注意勿损伤下方肌肉组织。

将止血钳插入切口，张开并闭合止血钳钳口以形成皮下囊袋。将装有目标试剂的渗透压微型泵插入囊袋中，并使用6-0非吸收性缝线缝合切口。随后，在密切监测下让小鼠恢复，直至其达到胸骨卧位。

编码细胞外基质蛋白弹性蛋白（elastin）的基因发生突变的胚胎，从胚胎发育第15.5天开始，在主动脉内层积聚过多的平滑肌细胞。在此过程中，利用多色Cre报告系统对平滑肌细胞进行克隆分析，结果显示这些细胞呈现多种颜色，表明其为多克隆来源。对离体主动脉组织切片进行免疫染色显示，弹性蛋白突变型胚胎在发育第15.5天的主动脉在体外培养18小时内即出现肌层增厚和管腔狭窄，而加入抗整合素β3阻断抗体可减弱这一过程。

从出生后第0.5天的野生型小鼠主动脉中分离出的平滑肌细胞表达平滑肌细胞标志物，但不表达CD31。从胚胎第13.5天开始，对妊娠母鼠持续输注整合素β3抑制剂，可显著减轻细胞外基质蛋白elastin突变小鼠的主动脉狭窄和过度肌化，但对野生型小鼠的主动脉无影响。

一旦掌握，若操作得当，渗透压微型泵植入技术可在不到10分钟内完成。遵循这些操作步骤，该方法还可推广应用于研究编码平滑肌的非血管组织，例如胃肠道或肺部组织。观看本视频后，您应能充分理解如何开展体内胚胎谱系示踪与克隆分析、原代培养胚胎主动脉组织、围产期主动脉平滑肌细胞，以及皮下植入渗透压微型泵。

请注意，操作小鼠、他莫昔芬和固定还原剂时可能存在危险，因此在进行这些实验操作时，必须采取预防措施，例如佩戴手套和实验服，并格外小心谨慎。