被动CLARITY透明化小鼠卵巢血管结构的三维重建

本方案的总体目标是提供小鼠卵巢卵泡中毛细血管分布的完整三维视图，并展示其相互关系。卵巢是生殖和内分泌学中的重要器官。对每种不同发育阶段的卵泡及其体细胞进行计数。

此外，与其他器官不同，卵巢的功能单位不表现出重复的分支结构。局部血管系统可能与神经系统一起，在成年女性的每个月经周期中均能发生显著变化。应用卵巢的被动透明化技术，可使我们观察到卵巢中各类细胞与卵泡的整体分布及其相互连接情况。

该方法的关键优势在于其对卵巢的影响最小，同时能够清晰显示多种标志物。通过显微图像的重建，我们提供了卵巢的完整图谱，可清晰观察到血管、神经和卵泡的细微结构。

进行图像分析时，使用 Imaris 的某些选项来评估卵巢与各结构之间的关系。根据文章说明配制灌注溶液，并将其置于冰上保存。麻醉小鼠，并确认小鼠无脚趾夹捏反应。

喷洒乙醇，于右心房处做一切口，随即以每分钟10 ml的速度向左心室快速灌注20 ml冰冻PBS，以彻底清除血液。随后以相同速度用冷的水凝胶溶液灌注动物。同时取卵巢及子宫，以保持卵巢形态的完整性。

将分离的卵巢转移至冰冷的水凝胶溶液中。在体视显微镜下清除卵巢周围的脂肪组织。为了获得更好的组织固定效果，建议去除卵巢囊膜。

将卵巢置于水凝胶溶液中保存三天。三天后，将卵巢转移至玻璃管中，并用新鲜的水凝胶溶液充满管子。用封口膜覆盖管口，然后在管颈处再缠绕一层封口膜。

确保封口膜与水凝胶溶液之间无气泡。将玻璃管置于37摄氏度的摇床培养箱中孵育两小时，直至凝胶形成。用滤纸小心去除卵巢周围多余的凝胶。

将卵巢放入一个15 ml离心管中，并加入10 ml透明溶液至管中。将离心管置于37摄氏度的摇床培养箱中，孵育至少两个月。前3天每天更换一次透明溶液，之后每周更换一次，直至卵巢组织完全透明。

所有免疫染色步骤均在37摄氏度的摇床上进行。首先，用PBST洗涤卵巢24小时。其次，将卵巢在用PBST稀释的一抗溶液中孵育两天。

第三，用PBST缓冲液洗去一抗。第四，将卵巢在PBST中与所需的二抗孵育两天。第五，用PBST缓冲液洗去二抗。

第六步，将卵巢转移至折射率匹配溶液中以实现折射率均一化。检查其视觉透明度，当卵巢完全澄清后即可进行成像。首先，准备一个洁净的玻璃底培养皿。

将橡皮泥搓成圆柱形，并塑造成马蹄形。将外缘紧密按压在载玻片上，形成一个密封的空间。橡皮泥的高度应略高于卵巢。

小心地将卵巢移至中心位置，并加入封片液。将培养皿盖在封固胶上，用两块封固胶固定。当卵巢准备好进行成像时，可选择配备16倍物镜的Nikon共聚焦显微镜对其进行成像。

使用共聚焦显微镜成像时，首先在 Ni-E 面板中选择物镜。在采集面板中，选择通道数量。首先使用 Eye Port 选项卡和 XY 控制摇杆，通过显微镜目镜观察，将组织移动至视野中央。

其次，在关闭快门光后，点击“Live”选项卡，调节每个通道的激光功率、高压（HV）和偏移量。在“Z轴强度校正”面板中调整最上层的采集设置，点击加号按钮定义顶层位置，将物镜向下移动至组织底部，设置适当的高压值和激光功率，然后添加最底层的信息，点击“To ND”以将设置同步至面板并开始采集。在采集设置中，首先设定扫描步数。

单击Z轴和大图的标签页。第二步，进入扫描大图窗口，根据组织的边界定义视野大小。第三步，返回ND采集界面，输入扫描视野的尺寸，并选择10%至50%之间的重叠率，然后单击运行Z轴校正，并等待成像过程完成。

首先使用imagic打开原始的NIS文件。点击图像按钮，选择颜色和显示通道，然后点击文件，选择图像序列，并分别将其保存为tiff文件。其次，使用Imaris打开其中一个tiff文件。

单击编辑按钮，选择添加通道以添加其余部分。名称和颜色可在显示调整中更改。组织的厚度也应在图像属性中进行校正。

第三，点击编辑按钮，选择“裁剪3D”以切除多余部分。首先，点击丝状结构按钮，然后点击下一步。进入切片面板，找到需要追踪的血管及其距离，然后返回“Surpass”界面，输入静态参数并点击下一步。

第二，调整起始点和设定点阈值。在相机面板中，选择“选择”功能，按住 Shift 键并点击相应点，以去除多余部分。第三，选择最高阈值，然后点击下一步。

请勿选择检测点，直接进入下一步。多余的部可以在编辑面板中删除。通过点击颜色可对其进行编辑。

通过CD31免疫染色后，研究了卵巢血管系统的三维结构。该三维结构可通过连续切片观察，也可通过整体容积渲染进行观察。已对成年小鼠卵泡血管系统进行CD31染色。

通过丝状结构重建毛细血管，我们可以展示各个卵泡与其毛细血管之间的关系。卵巢如同女性一样，始终处于活跃且可变的状态。然而，由于传统组织学分析的局限性，要描述这些复杂组分之间的相互关系非常困难。

新开发的被动透明化方法可能有助于我们克服光学障碍，保持整个组织的完整性，并提供功能线索。