三维重建与分析免疫标记并透明化处理的人类胎盘小叶血管网络

本实验的总体目标是生成适合分析其内部血管网络的胎盘绒毛树片段的三维重建图像。该方法有助于回答本领域的一些关键问题，例如胎儿生长受限的原因，或导致早产的压力类型及其严重程度。本方法的主要优势在于，我们现在能够对透明化的胎盘绒毛树组织进行免疫标记，进而可视化其血管网络，并利用这些可视化结果对血管网络进行表征与分析。

该技术的意义可延伸至多种诊断和治疗领域，因为大多数生命科学均依赖于二维组织学表征。本次操作将由 Valerie Schwenk 女士示范，她将进行胎盘组织的免疫标记和透明处理；随后 Phillip Necaise 先生将进行胎盘组织的解剖以及组织的逆向透明处理。为准备绒毛树的解剖，首先用磷酸盐缓冲液冲洗福尔马林固定后的胎盘组织。

然后将组织置于解剖显微镜载物台上的培养皿中。使用手术刀和精细镊子撕开胎盘组织，以找到绒毛树。随后，解剖下长约五毫米的绒毛树组织片段，并转移至含有1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）的微量离心管中。

更换新鲜的磷酸盐缓冲液，静置10分钟，期间偶尔轻轻摇晃。随后，将磷酸盐缓冲液替换为通透缓冲液，以对组织进行通透处理，并阻断二抗的非特异性结合。然后孵育30分钟。

然后，用含2%小牛血清并加入小鼠单克隆抗CD31和兔抗CK7抗体的磷酸盐缓冲液替换通透缓冲液，于4°C孵育过夜。次日，用含2%小牛血清的磷酸盐缓冲液进行额外洗涤，以去除残留抗体。

然后，去除含2%山羊血清的磷酸盐缓冲液，加入相同的缓冲液，其中添加与绿色荧光染料偶联的山羊抗小鼠免疫球蛋白G以及与红外荧光染料偶联的山羊抗兔免疫球蛋白G。室温避光孵育30分钟。随后，用PBS-GS洗涤组织一次，并将标记后的组织置于室温避光保存，直至透明化处理。

用 PBS 每 10 分钟清洗样品一次，共清洗三次。为脱水组织，移除磷酸盐缓冲液，加入 50% 乙醇处理组织，孵育 10 分钟。孵育后，弃去液体，随后用 70% 乙醇每 10 分钟清洗一次，共清洗三次，再用 100% 乙醇每 15 分钟清洗一次，共清洗三次。

然后，使用尖头镊子将组织转移至含有1毫升溶液一的微量离心管中，孵育4小时。4小时后，将组织转移至含有溶液二的微量离心管中，继续孵育4小时。若需将组织置于Sykes-Moore孵育室中，可使用尖头镊子将直径25毫米的圆形盖玻片放置在孵育室底座上。

再次使用尖头镊子将橡胶垫圈放入盖玻片底部。取出浸在溶液二中的组织，将其置于盖玻片中央。然后，在组织上滴加一滴溶液二，约 40 µL。

然后，取第二片盖玻片放置在垫圈上方。接着，将锁定环旋入底座顶部，以牢固压紧盖玻片和垫圈。随后，将一根25号针头穿过垫圈插入底座的端口内。

接下来，用3毫升注射器吸取1.5毫升溶液二。然后，在注射器上安装25号针头，并通过垫圈将针头插入对侧端口。随后，开始向腔室内注入溶液二，并检查腔室内的空气是否正通过另一支25号针头排出。

当腔室充满液体后，取下针头和注射器，将 Sykes-Moore 腔室支架放置在共聚焦显微镜载物台上。使用 10X 物镜对准腔室中的组织。接着，为载物台设定一个参考点，并上下移动显微镜载物台通过焦平面，以识别并确定组织的顶部和底部位置。

将步长设置为2.5 µm，采集一组从组织顶部到底部的共聚焦图像文件。然后，将组织转移至含有超过其体积20倍的100%乙醇的微量离心管中，以逆转透明处理。随后每隔一小时依次更换为70%乙醇和50%乙醇，最后更换为磷酸盐缓冲液（PBS）。

避光保存于 4°C，直至包埋。此处为展示胎盘血管网络，已获取人胎盘的显微镜与共聚焦显微镜图像。这些胎盘显微图像显示了已侵入胎盘实质的辐射状绒毛树结构。

这些显微图像显示了绒毛树远端部分的存在，其末端终止于绒毛簇中。接下来，为了显示绒毛的滋养层结构，对绒毛树的远端部分进行了免疫标记。在图像中，外层滋养层呈绿色，毛细血管呈红色。

随后，为了检测组织清除前后胎盘组织的情况，获取了未清除和已清除胎盘组织的共聚焦显微图像。图像显示，对于未清除的组织，免疫荧光信号仅能在组织深度100 µm或更浅的范围内被捕捉到；而相比之下，对于已清除的胎盘组织，免疫荧光信号可在更深的组织层次中被成功捕获。

此外，为了将常规组织与反转透明化后的切片进行比较，将透明化组织通过乙醇逆向脱水。胎盘组织在透明化前后使用抗CK7抗体进行免疫组织化学染色，结果显示透明化过程未引起组织形态的显著改变。动画显示，免疫染色的绒毛组织分布在整个组织体积的全层深度。

当你熟练掌握该操作流程后，预计总共需要约18小时，分三天完成。在尝试进行该操作时，需牢记其涉及多种不同的技能要求，包括胎盘病理学分析和共聚焦显微镜技术等。

您需要能够生成成像的三维重建图像，并且需要熟悉免疫处理与分析。在此步骤之后，可以开展其他方法，如传统组织学、STS凝胶电泳或基质辅助激光解吸电离（MALDI）等。随着该技术的发展，其为探索子痫前期、胎儿生长受限及胎儿窘迫的根本病因，在母胎医学、新生儿学以及滋养层生物学领域开辟了新的途径。

观看本视频后，您应能够充分理解如何对胎盘绒毛树组织进行透明化处理、成像及分析。非常感谢您观看本视频，祝您的实验顺利成功。