基于流式细胞术的药物筛选系统用于鉴定促进胶质母细胞瘤干细胞分化的小分子

本实验的总体目标是筛选小分子文库，以寻找能够促进胶质母细胞瘤干细胞向星形胶质细胞分化的化合物。该方法有助于回答肿瘤干细胞领域中的关键科学问题，例如：哪些信号通路对于维持胶质母细胞瘤干细胞的未分化状态至关重要？正确实施该技术可直接鉴定出能够促进胶质母细胞瘤干细胞分化的活性小分子。

该技术的应用意义在于为埃勒斯-当洛综合征性胶质母细胞瘤的治疗提供新思路，因为降低胶质母细胞瘤干细胞的比例可能减少肿瘤复发的可能性。该方法还可通过使用其他报告基因构建体，应用于诱导向其他细胞谱系分化的研究。本研究首次建立了一种高通量筛选方法，用于发现能够促使胶质瘤干细胞分化的化合物。

在源自患者的癌细胞中操作慢病毒颗粒可能具有极高的危险性。因此，必须始终遵循处理血液传播病原体的标准操作规程。首先，在六孔板中，将一百万个胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）接种于两毫升完全神经干细胞生长培养基中。

接下来，以感染复数等于5的慢病毒报告系统转导细胞。向细胞与病毒混合物中加入2微升聚凝胺，使终浓度为8微克/毫升，并将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。孵育结束后，更换培养基以去除未结合的病毒。

以360 × g离心细胞5分钟。然后小心吸除培养基，将细胞重新接种至6孔板中，并继续培养24小时。

收集总共0.5毫升的培养液体积。在室温下以360 ×g离心5分钟，使细胞沉淀。将细胞重悬于0.5毫升新鲜的神经干细胞生长培养基中。

将培养板放回培养箱中，孵育至少72小时以促进细胞扩增。加入200 µL解离试剂，置于37 °C水浴中孵育5分钟。通过轻柔吹打使细胞解离。

向解离的细胞中加入 800 微升 HBSS，以确保细胞最小程度地贴壁或聚集。接着，将每种细胞悬液各 200 微升转移至 96 孔板的孔中。通过流式细胞术测定表达绿色荧光蛋白的细胞百分比。

每次检测至少记录 10,000 个活细胞。在所有流式细胞术分析中，使用亲代非转导细胞或转导空载体但无荧光的细胞来确定基线荧光水平。为筛选并扩增单个亚克隆，将细胞以每孔 0.7 个细胞的密度接种于 96 孔板中，每孔含 100 微升神经干细胞培养基。

将这些克隆在培养条件下维持 11 天。观察直径大于 100 微米的神经球。我们此前已确定该尺寸阈值，用于回溯判断神经球是否起源于具有自我更新能力的胶质母细胞瘤干细胞。

在使用不同的胶质母细胞瘤细胞模型时，该截断尺寸可能需要优化。使用配备FITC滤光片的荧光显微镜观察细胞，并标记含有单个神经球的孔，其中约1%至5%的细胞为GFP阳性。标记后，扩增单个克隆，直至获得足够数量的细胞用于流式细胞术分析。

假设报告基因克隆中含有1%至5%的GFP阳性细胞，从每个克隆中收集0.5毫升细胞，并同时收集等量的未转导对照细胞，以确定GFP阳性细胞的确切百分比。在室温下以360 × g离心5分钟使细胞成团后，吸除上清液。向每个细胞沉淀中加入200 µL解离试剂，将试管置于37°C水浴中孵育。

孵育后，将细胞吹打约20至30次，以获得单细胞悬液。然后加入800微升HBSS，以尽量减少细胞贴壁或聚集。现在将每种细胞悬液各200微升转移至96孔板的孔中。

最后，进行流式细胞术检测，每份样本至少采集10,000个活细胞。为评估克隆形成能力，通过反复吹打20至30次制备分化报告基因亚克隆的单细胞悬液。随后将这些细胞以每孔约5至500个细胞的密度，接种于96孔板中，每孔加入100微升完全神经干细胞生长培养基。

将这些细胞在培养条件下维持 9 到 11 天。在光学显微镜下观察神经球的形成。若某一孔中至少含有一个单个的大型神经球，则判定为阳性。

将亲代未转导细胞和GFP阳性慢病毒转导细胞作为对照，输入ELDA在线分析界面中检测的总孔数及阳性细胞数。开始筛选时，在96孔板中每孔接种5000个细胞，加入99微升完全神经干细胞培养基。随后使用12通道移液器，向各孔加入稀释后的文库化合物，使终浓度为2微摩尔，或加入DMSO对照。

将细胞孵育72小时。现在使用12通道移液器向每孔加入150 µL细胞解离试剂，于37°C孵育20分钟。然后使用12通道移液器在每孔中轻柔吹打细胞约20至30次，直至形成单细胞悬液。

现在进行流式细胞术分析，确定表达 GFAP:GFP 报告基因的细胞百分比。首先根据前向散射和侧向散射信号判断细胞大小和活性，并圈选活细胞群体。然后在活细胞群体中确定 GFP 阳性细胞的比例。

与对照组相比，GFP阳性细胞比例增加三个标准差被视为阳性结果，该标准可根据用户对严格程度的偏好进行调整。图中展示了表达低水平和高水平GFAP:GFP的HSR-GBM1 GSC亚克隆的代表性图像。通过流式细胞术对患者来源的神经球细胞系中GFAP:GFP表达阳性的亚克隆进行筛选。

此处，GFAP:GFP 低表达表示克隆中少于 5% 的细胞为 GFP 阳性，而 GFAP:GFP 高表达表示克隆中超过 75% 的细胞为 GFP 阳性。这些结果表明，通过 ELDA 测定，GFAP 低表达亚克隆的体外自我更新能力高于 GFAP 高表达亚克隆。因此，GH 亚克隆比 GL 亚克隆更具分化特征。

最后，通过筛选药物文库以鉴定能够诱导GSCs发生星形胶质细胞分化的化合物，发现有12种药物可显著增加表达GFAP:GFP报告基因的细胞比例。一旦掌握该技术，若操作得当，可在数周内完成。

在完成该实验步骤后，可进一步采用其他方法，如刃天青还原法（alamarBlue assay）、半固体培养基中的集落形成实验（clonogenic assay）、皮下移植或颅内异种移植接种等，以回答更多科学问题，例如特异性药物对细胞增殖和体外集落形成能力的影响，以及对体内成瘤性的作用。观看本视频后，您应能够充分掌握如何鉴定能够诱导胶质母细胞瘤干细胞向星形胶质细胞分化的化合物。