一种利用患者来源的胶质瘤干细胞快速筛选胶质母细胞瘤潜在联合疗法的工作流程

胶质瘤干细胞是胶质瘤中的一类细胞亚群，通常对化疗和放疗具有抗性。本文介绍了一种快速鉴定靶向胶质瘤干细胞（而非已分化胶质瘤细胞）的联合治疗方案的方法。与其他可能繁琐且复杂的方法相比，该方法更为高效。

本方案是一种相对简单且快速的方法，用于鉴定潜在的有效药物组合。首先从培养基中收集胶质瘤干细胞（GSCs），在室温下以70 × g离心3分钟。去除上清液后，在37°C下用Accutase消化细胞4分钟。

使用200微升枪头反复吹打细胞，以解离并重悬细胞沉淀。将神经胶质瘤干细胞（GSCs）以每毫升培养基200,000个细胞的密度接种至12孔培养板的每个孔中，并过夜培养。次日，向每孔中加入30微升的荧光素酶-eGFP病毒上清液。

在25°C条件下，以1000 × g离心细胞两小时，并过夜孵育。次日，通过收集GSCs、离心、移除上清液、重悬于新鲜培养基中并重新接种，更换孔板中的培养基。继续培养细胞48小时。

在荧光显微镜下观察培养板，确认出现 GFP 阳性细胞。使用流式细胞分选仪分选并收集高荧光强度的 GSCs，并进行进一步培养。使用细胞外基质混合物（如 Matrigel）包被 96 孔光学底板，并在 37°C 下孵育 1 小时。

除去多余的混合物，用 PBS 轻轻冲洗培养板一次，然后在每孔包被的培养板中加入 100 微升培养基，以每孔 1000 个细胞的密度接种 XG387-Luc 细胞，并在培养箱中培养过夜。次日，在显微镜下观察细胞，确认其已贴壁。随后，用培养基配制 200 微摩尔的替莫唑胺溶液以及 2 微摩尔的目标药物溶液。

进行联合药物筛选时，移除空白培养基，并向每个孔中加入含有200微摩尔替莫唑胺或2微摩尔靶向药物，或二者联合的培养基，每种处理设三个技术重复。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育三天。使用IVIS Spectrum成像系统拍摄培养板中细胞生物发光的图像。

使用内置软件创建多个圆形感兴趣区域，并对细胞生物发光进行定量。为了筛选可能增强替莫唑胺抗胶质母细胞瘤效应的潜在候选药物，通过药物组合筛选分析了20种靶向选择性小分子抑制剂。13种靶向制剂的敏感性指数值高于零，其中5种高于0.1。

两种候选药物UMI-77和A 83-01的敏感性指数均高于0.25，提示它们具有与替莫唑胺协同作用的潜力。通过六浓度×六浓度剂量滴定矩阵的抗增殖实验，评估了替莫唑胺与UMI-77联合治疗的效果。联合用药指数值均小于1。

在不同浓度的替莫唑胺与UMI-77联合作用下，大多数组合的高单药值均大于零，表明替莫唑胺与UMI-77在XG387和XG328 GSCs中均表现出总体协同作用。该方案也可通过简单去除培养板包被步骤，应用于贴壁癌细胞的药物组合筛选。