简单去除福尔马林固定人脑组织中背景荧光以进行免疫荧光显微镜检测

免疫荧光显微镜中常见的问题是内源性背景荧光的存在，这可能会干扰您的信号。在许多情况下，这种自发荧光会使实验结果无法解读。在本方案中，我们将演示如何使用商用LED台灯通过光漂白去除人脑组织样本中的自发荧光。

该方法的主要优势在于与现有技术相比可显著节约成本，且不牺牲效果，同时不会向样品中引入任何外源性化合物。实验开始前，需配制1倍浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）和10%叠氮化钠的储备液。每处理三张标准尺寸的显微镜载玻片，需要准备一个100毫米×100毫米的方形培养皿作为载玻片孵育盒。

对于每个载玻片腔室，通过将25毫升10%叠氮化钠加入50毫升1倍TBS中，配制50毫升0.5%叠氮化钠TBS溶液。搭建一个支架，用于抬高载玻片腔室，以便灯头可以置于其下方。对于100毫米方形培养皿，可将大小相似的塑料食品容器裁剪成合适形状使用。

任何能够稳固抬升载玻片腔室且不妨碍光线到达样品的装置均可使用。准备一个白光磷光LED台灯，并移除覆盖光源的任何扩散器或不透明塑料。将LED阵列朝上放置。

为此，建议使用带有柔性颈部的灯。通过将足够覆盖载玻片腔室和支架的大盒子内侧用铝箔覆盖，为装置构建一个反光穹顶罩。对于单个腔室，可使用一个一毫升移液器吸头盒。

本视频中，采用福尔马林固定的额颞叶变性-T型（FTLD-T）人脑眶额回脑组织进行光漂白预处理。组织制备及氨基染色步骤可能因组织切片的来源、固定方式和包埋方法不同而有所调整。在4°C的低温室、低温柜或冰箱中，将光源置于支架下方，样本室放置于支架上方。

用 50 毫升叠氮化物 TBS 填充样品室。使用洁净的镊子将贴有 10 微米厚组织切片的标准玻璃显微镜载玻片浸入样品室中。用反射穹顶盖住装置，并打开 LED 灯。

让样本光漂白48小时。该孵育时间可能因光源强度和组织中自发荧光物质的含量不同而有所变化。完成光漂白预处理后，可按照针对特定组织和目标蛋白的标准方案对切片进行免疫染色。

为演示目的，使用与 Alexa 488 和 Texas Red 偶联的二抗对 FTLD-T 脑组织进行磷酸化 tau 蛋白染色。DAPI 用作细胞核复染剂。配制 500 毫升抗原修复缓冲液、500 毫升含 0.025% Triton X-100 的 TBS 溶液、10 毫升含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 TBS 溶液，以及 2 毫升封闭液，封闭液由羊血清加入 BSA TBS 溶液中配制而成。

将光漂白的切片浸入切片盒中的抗原修复缓冲液内，进行抗原修复。将切片盒在90摄氏度下加热30分钟。从热处理中取出切片盒后，必须在室温下冷却30分钟。

立即移除载玻片将导致切片干燥。根据制造商的建议配制一抗混合液。本实验中，抗磷酸化 PHF tau p-丝氨酸 202 和苏氨酸 205 的 AT8 抗体用 BSA-TBS 按 1:100 稀释，并置于冰上保存。

每个切片需要150 µL抗体混合液。切片冷却30分钟后，将载玻片从抗原修复收集容器转移至盛有TBS Triton的染色缸中。在此溶液中轻轻振荡洗涤5分钟。

清空并更换 TBS Triton，以重复此洗涤步骤第二次。洗涤后，从染色缸中取出载玻片，并用吸水纸吸去多余的缓冲液。使用疏水笔在组织周围画出轮廓线。

这可以防止溶液从载玻片上流失。注意不要让载玻片干燥。用移液器将200 µL封闭液加到载玻片上，封闭组织，并将载玻片置于湿化 chamber 内。

该孵育室可以简单到只是一个装有湿润纸巾的移液器吸头盒内的载玻片架。确保整个组织样本均被封闭液覆盖。室温孵育两小时。

用移液器或抽吸装置移除封闭液。向切片上加入100至150微升的一抗混合液。确保整个样本被抗体溶液覆盖，并将切片置于水平面上，以避免抗体溶液分布不均。

在湿盒中，4摄氏度下与一抗孵育过夜。次日，配制二抗混合液。本实验中，使用BSA-TBS将 goat anti-mouse Alexa 488 和 goat anti-mouse Texas Red 按1:100稀释。

取出组织切片，用移液器或抽吸装置去除一抗溶液。将载玻片置于盛有 TBS Triton 的染色缸中，以与之前相同的方式洗涤两次，每次洗涤五分钟。洗涤后，用吸水纸吸去多余的缓冲液。

加入100至150微升二抗溶液，确保组织样本再次被完全覆盖。在湿盒中室温避光孵育两小时。根据厂家说明书或系列稀释法，用TBS配制0.1微克/毫升的DAPI复染液。

由于DAPI储存液可能出现不溶性，务必充分混匀。取出载玻片并移除二抗混合液。用TBS缓冲液洗涤样本两次，但此时不再使用含Triton的TBS，而是使用普通的TBS。

吸去或用移液器移除残留的洗涤液，然后向组织切片上滴加100至150微升DAPI染液。室温避光孵育10分钟。取出样本，用不含添加剂的TBS洗涤三次，而非两次。

洗涤后，小心去除残留的洗涤液。加入封片剂，并用盖玻片覆盖样本，完成玻片封片。

使用镊子将盖玻片的一边先放下，再缓慢降低对侧边缘，以避免产生气泡。让封片剂干燥后，于4°C避光保存。载玻片现已准备好用于观察。

荧光显微镜的设置将根据所使用的荧光染料和显微镜型号而有所不同。打开荧光灯、显微镜和计算机，让光源预热15分钟。将染色的组织切片放置在荧光显微镜下。

使用明场在10倍放大倍数下定位组织。找到合适的组织区域后，在样品的盖玻片上滴加一滴水。切换至20倍水浸物镜。

为获得最佳信号，应针对每种荧光染料在独立的通道中选择合适的激光激发波长和发射波长。相关设置及所用波长的更多细节详见随附的论文。调整激光功率和增益设置，以优化每个通道的信号强度。

找到合适的设置和视野后，保存包含每条轨迹荧光数据的复合图像。为了可视化各通道的荧光强度，请为 ImageJ 安装 RGB Profile Tools 宏。在 ImageJ 中打开 lsm 共聚焦图像文件，并通过“图像”→“颜色”→“通道工具”将三个图层的复合图像转换为 RGB 模式。

选择复合图像并勾选所有三个通道。接着，转到图像、类型和RGB颜色。选择RGB配置文件工具图标，并在需要分析的图像区域上画一条线。

在本视频中，已介绍了对组织样本进行光漂白预处理以产生背景荧光的步骤。该操作可在抗原修复和氨基染色之前的任何标准氨基荧光实验方案中加入。用于光漂白的装置价格低廉且易于获取，由市售组件构成。

白光磷光LED在较宽的波长范围内发射光线，因此非常适用于广谱漂白。使用一种常见的LED台灯，对未经染色的人类FTLD-T脑组织样本进行光漂白，并采用适用于Texas Red和Alexa 488染色样本的波长进行成像。未经处理的样本显示出大量自发荧光。

相比之下，光漂白导致类似于脂褐素的自发荧光颗粒以及总体背景荧光的强度显著降低。为了进一步验证该技术，对额颞叶变性-T（FTLD-T）脑组织样本进行了染色，以检测过度磷酸化的tau蛋白——这种蛋白在该疾病中会发生错误折叠，并以独特的包涵体形式积聚。使用了两种不同的二抗，以更好地区分tau蛋白标记与非特异性荧光。

在这些复合图像中，Alexa 488 与 Texas Red 的共定位显示为黄色，代表正确染色的 tau 蛋白。红色或绿色区域的出现表明存在非特异性荧光或其中一种发色团的淬灭现象。在未经处理的对照样本中，可见明显的背景信号和非特异性信号，尤其是在 Texas Red 通道中。

光漂白预处理以及化学淬灭剂的应用均可显著降低背景信号。如果我们将荧光通道分开并在更高放大倍数下观察图像，则可获得更详细的观察结果。未经处理的对照组在所有通道中均存在背景荧光，以及非特异性信号，主要出现在Texas Red通道中，其强度与tau蛋白特异性标记信号相似。

如果tau包涵体没有明确且可预测的形态，这些Texas Red结果可能会因存在自发荧光特征而被误读。光漂白预处理可完全消除这些Texas Red非特异性信号，同时保留大部分tau特异性的Texas Red和Alexa 488信号。然而，光漂白似乎对DAPI背景荧光影响甚微。

化学淬灭剂在降低Alexa 488通道背景荧光方面与光漂白效果相当。然而，它同时也降低了DAPI和Texas Red的荧光强度，提示存在一定的不利淬灭作用。这些效应的定量分析结果可在信号轮廓图中观察到。

如您所见，该方法可产生无干扰特征的清晰图像。这种光漂白预处理可整合到任何标准的氨基酸荧光实验方案中，以去除自发荧光，获得高质量且明确无误的结果。