利用自动化微型生物反应器技术优化异源蛋白生产的通用方案

本迭代工作流程的总体目标是将基于克里金法（Kriging）的实验设计与微型生物反应器技术相结合，以实现足够的培养通量，从而提出一种可定制化设计微生物培养基的通用方法。该方法有助于回答微生物生物工艺开发领域中的关键问题，例如培养基优化、生物工艺条件优化以及菌株表型分析。我们最初产生该方法的想法，源于思考：为小分子代谢物生产而优化的培养基，是否同样适用于异源蛋白的生产。

该技术的主要优势在于通过实验与建模的智能结合，显著缩短整体研发周期。本实验操作将由我实验室的博士生Roman Jansen进行演示。首先，按照文本方案中的详细说明，进行研究构思与方法定义。

在工作台上，用70%乙醇擦拭深孔板后，在层流罩中干燥，以对用于储存母液的深孔板进行灭菌。通过将工作细胞库中的一个等分试样接种到含有25毫克/升卡那霉素的50毫升BHI培养基中，启动种子培养。将所有必要的实验器具放置在机器人工作台上，并将母液倒入相应的实验器具中。

然后，启动培养基制备的自动化工作流程，确保最后一个步骤即接种步骤能够及时完成，以赶上种子培养的开始时间。在接种后约两小时取样，通过测量600纳米处的光密度（O-D-600）来监测菌体生长情况。此后每小时持续监测一次生长情况。

大约五小时后，培养物的 600 nm 光密度（O-D-600）达到 3 至 4 之间，可用于接种主培养物。将种子培养物置于液体处理工作站的工作台上，并继续进行培养基制备流程。接种后密封培养用微孔板。

接下来，将密封的培养M-T-P放入Biolector设备中，然后启动预设的培养程序。如有必要，根据生物安全规定处理剩余的储备溶液。

然后，从机器人工作台接种培养物。在启动液体处理设备的去污程序之前，先清洁可重复使用的实验器具。主培养运行17小时后停止，并按照文本方案中所述处理数据。

为了定量测定G-F-P滴度，首先将所有培养孔中的细胞悬液转移至预先标记的反应管中。然后，使用台式离心机以最大速度离心10分钟，以获得无细胞的上清液。接着，将每种无细胞上清液各200微升转移至底部透明的黑色96孔M-T-P板中。

使用适当的酶标仪，在488纳米激发波长和520纳米发射波长下读取G-F-P特异性荧光。测定G-F-P荧光后，可直接使用该微孔板，按照Bradford或B-C-A等标准方案测定无细胞上清液中的蛋白质含量。最后，按照文本方案中所述进行数据分析。

所展示的实验流程构成一轮实验，其结果用于设计下一轮实验，以期最大程度地提高G-F-P信号。每轮实验中均设置对照实验，用于分析数据的变异性并识别实验中的异常值。该等高线图概括展示了优化过程的整体情况。

通过对前三轮迭代收集的数据集进行分析，揭示了镁的促进作用存在局限性，并确定了其最佳浓度范围。因此决定在第四轮迭代中仅进一步扩大钙的浓度范围。在第五轮和第六轮迭代中，该实验程序重复进行了两次，直至观察到绿色荧光蛋白信号达到饱和。

这种饱和现象可通过所施加的钙浓度下钙盐的沉淀来解释，此时钙无法被细胞利用。第七次迭代用于更详细地探索边界条件。通过统计学Z检验，可可靠地确定产生饱和G-F-P信号的培养基组分的最佳浓度范围。

该图显示了使用Kringing kit工具箱确定并可视化分析出的平台期。Kringing kit工具箱可免费获取，并附有详细教程，说明如何使用其各项功能。本方案具有通用性，可进行多种调整，例如用于研究其他微生物表达宿主，或优化目标蛋白的其他特性，如糖基化模式或二硫键形成。

胚胎系统的整合提高了实验通量，从而在以羊膜系统替代完全可控且受环境影响的生物反应器时节省大量时间。然而，必须考虑结果的可扩展性。数学建模与实验设计有助于针对研究目标最大化测量数据的信息含量。